HDV,RNA检测的临床意义与方法

林妍雪，秦艳丽，张继明

复旦大学附属华山医院感染科，上海市传染病与生物安全应急响应重点实验室，国家传染病医学中心，上海 200040

HDV是由意大利Rizzetto等［1］从重症乙型肝炎患者肝组织标本中发现并于1977年首次报道。HDV RNA与HDAg结合为核衣壳，依赖HBsAg包膜进行包装从而进出肝细胞建立感染，即HDV是HBV的卫星病毒［2－3］。虽然HDV是迄今为止已知对人有感染性的最小病毒，基因组长度仅有1672～1697 bp［4］，但是能够导致最严重的病毒性肝炎。HDV感染主要有两种形式，一种是患者首次同时暴露于HBV和HDV，称为HBV/HDV联合感染（co－infection），多数可自发康复，少数转变为重症肝炎；
另一种是在既往感染HBV的基础上暴露于HDV，称为重叠感染，其中70%～90%将发展为慢性HDV感染［5－6］。与HBV单一感染相比，合并HDV感染会加速肝脏炎症进展至肝硬化、肝癌及其他终末期肝病［7－9］，平均于5年内进展为肝硬化，10年内进展为肝细胞癌［10］。

由于各地区HDV感染的发病率、检测率不一，检测手段的灵敏度、特异度参差，不同研究对于丁型肝炎的流行率统计结果不尽相同。近年发表的几篇大型Meta分析显示，目前全球HDV感染者总数约为1200万～6000万，甚至可能达到7200万，HDV流行率在总人群中为0.16%～0.8%，在HBsAg阳性人群中达到4.5%～13%［10－12］，颠覆了既往人们普遍认为丁型肝炎发病率低的看法。

由于HDV的传播依赖于HBV，关于丁型肝炎诊治的意见多是在HBV相关指南中提出。2015年世界卫生组织（WHO）慢性乙型肝炎指南提出HDV的活动性感染应该由高滴度的HDV抗体诊断，通过血清HDV RNA检测来证实［13］。2015年亚太肝病学会（APASL）推荐通过HDV RNA、HDV抗原或抗HDV IgM检测来确认HDV活动感染［14］。2017年欧洲肝病学会（EASL）推荐在所有慢性乙型肝炎患者中筛查各类血源传播病毒［15］。2018年美国肝病学会（AASLD）建议对具有HDV感染风险的HBsAg阳性者进行丁型肝炎检测，包括HIV感染者、注射吸毒者、男男性行为者、来自HDV高流行地区的移民，以及HBV DNA低但转氨酶高的患者；
其推荐的筛查测试是HDV

抗体，测试结果为阳性的进一步进行HDV RNA检测以诊断活动性HDV感染［16］。目前不同指南对于丁型肝炎筛查对象及诊断方案的意见并不完全一致，不过检测现状显然没能达到上述任一指南的要求。本文就HDV RNA检测的临床意义及方法进展进行综述，以期推动丁型肝炎筛查的普及和检测质量的提高。

1.1 血液中检出HDV RNA是丁型肝炎现症感染的金标准 长期以来，对于HDV感染的评判常常是通过酶免疫法或放射免疫法来检测HBV感染者血清中是否存在HDV抗体。这一方法操作简便且成本低廉，但其不足也显而易见：其一，在丁型肝炎感染早期，血HDV病毒载量迅速上升，而抗体却迟迟不能检出，HDV抗原虽在一段时间后可以测得，但不久就会同机体产生的抗体结合形成复合物，此时若依赖HDV抗原抗体检测结果则有很大概率出现漏诊［17－18］。其二，HDV IgG在HDV感染后长期存在，其阳性结果只能说明既往有过感染却无法体现感染是否仍然持续。其三，现有的HDV抗体检测试剂盒良莠不齐，灵敏度不尽如人意，上海一项研究［19］使用抗HDV－IgG商业试剂盒对225例转氨酶升高的HBsAg阳性患者进行血清抗体检测，结果无一阳性，但对同一批样本进行HDV RNA检测后发现阳性率达到4.9%。

肝组织中检出HDAg及血中检出HDV RNA都是HDV复制的直接证据，可作为丁型肝炎现症感染的可靠依据［20］，然而HDAg与抗－HDV形成免疫复合物导致其不易检出，灵敏度欠佳，且肝活检有一定创伤性而难以常规开展。血HDV RNA检测则因其兼具灵敏度和实用性而被公认为诊断活动性HDV感染的最佳指标。在临床实践中，血清/血浆中HDV RNA不能检出是诊断丁型肝炎治愈的必要条件。

1.2 HDV病毒血症与丁型肝炎不良预后相关 在丁型肝炎抗体阳性人群中，检出HDV RNA的患者有着更差的临床结局。西班牙一项研究［9］对118例抗－HDV阳性患者中位随访8年后，起始测得HDV RNA阳性的患者更容易发展为肝硬化（31%vs 0，P＝0.002）和肝脏失代偿（28%vs 3%，P＝0.019）。瑞典多家二级医院合作开展的中位随访6.5年的观察研究［21］发现，在337例HDV抗体阳性患者中，有HDV病毒血症的患者肝脏不良事件的发生率为无HDV病毒血症患者的3.8倍。意大利一项对299例HDV感染者长达28年的随访研究［7］中，HDV持续复制造成肝硬化和肝细胞癌的年发病率分别为4%和2.8%，是肝脏相关病死率的唯一预测指标。Romeo等［22］发现对于就诊时尚未发生肝硬化的丁型肝炎患者，其HDV病毒血症水平越高，进展为肝硬化和肝细胞癌的倾向就越大。而与HDV RNA持续阳性或一过性阴转的患者相比，HDV RNA清除与更高的无事件生存率显著相关［23］。

1.3 启动丁型肝炎治疗有赖于HDV RNA精确定量 对于丁型肝炎患者，“早发现、早诊断、早治疗”有助于延缓甚至逆转疾病进展，从而改善预后。通过对HBsAg阳性的患者检测HDV RNA，有助于及时识别丁型肝炎患者，确定其治疗方案是单独使用核苷（酸）类似物、还是单独使用聚乙二醇干扰素（PEG－IFN）或者二者联合治疗［16］。目前推荐代偿期慢性丁型肝炎患者的首选治疗方案为PEG－IFN应用至少48周；
由于核苷（酸）类似物对HDV感染无效，因此不建议将其用于除肝硬化患者之外的HBV低复制的患者；
而对于HBV DNA持续复制或水平升高的丁型肝炎患者，则应考虑核苷（酸）类似物治疗［15－16］。

更高的HDV RNA检测灵敏度意味着更多丁型肝炎患者能够被识别和救治。德国一项研究［24］使用RoboGene HDV RNA定量试剂盒（首款通过CE－IVD认证的HDV RNA试剂盒）对以往HIDIT－Ⅱ临床试验中收集的372个血液标本重新进行HDV RNA检测，因最低检出限由原来的930 IU/mL降低到了14 IU/mL，此前检测为阴性的血液标本中有1/3复测得到阳性结果［25］。

1.4 HDV RNA水平是监测和预测抗HDV药物疗效的主要指标 Farci等［26］开展了用不同剂量IFNα－2a治疗慢性丁型肝炎患者的随机对照临床试验，发现相比于低剂量IFN治疗组和未治疗组，高剂量IFN治疗组患者血清HDV RNA滴度显著持续下降，相对应地，其停药后的肝脏组织病理、临床结局、生存率也有不同程度改善。Keskin等［27］发现PEG－IFN治疗24周的HDV RNA水平是疗程结束24周时病毒学应答的独立预测因素；
HDV RNA下降幅度可以预测治疗结局［28－29］。Yurdaydin等［30］对IFN治疗后的丁型肝炎患者开展了中位时间为55个月的随访研究，产生持续病毒学应答（停药后HDV RNA持续阴性至少两年）的患者与未产生持续性应答的患者相比，出现并发症和死于肝脏相关疾病的概率都明显降低。Bulevirtide、lonafarnib等丁型肝炎治疗新药仍在审评中［31］，用药前后对患者HDV水平进行长期准确定量使得在国际多中心临床试验中评估HDV新疗法的优劣成为可能，也是制定丁型肝炎患者管理共识的必经之路。目前各临床试验中丁型肝炎治疗目标暂无统一意见，通常以停药6个月以后无法检测到血清HDV RNA或者疗程结束时HDV RNA较基线下降≥2 log作为疗效指标［32］。

1.5 HDV RNA检测是对HDV进行基因分型的基础 HDV具有广泛的遗传多样性，全基因组序列的变异程度可达40%，目前通过对已知毒株RNA序列进行系统发育分析将其分为8种基因型（HDV－1～8），各基因型还可进一步分为2～4种基因亚型［33－34］。通常，全基因组核苷酸序列相似度＞80%或基因组R0区域（889～1289）核苷酸序列相似度＞85%的两个病毒株同属一个基因型，全基因组核苷酸序列相似度＞90%（HDV－1＞84%）的两个病毒株属于同一个基因亚型［34］。不同HDV基因型和基因亚型的地域分布有所差异，亚洲主要分布有HDV－1、HDV－2和HDV－4［4，33－34］。

HDV基因型与丁型肝炎临床病程及结局相关联。Su等［35］研究表明，中位随访135个月后HDV－1型感染者相较于HDV－2型感染者有更低的临床缓解率（15.2%vs 40.2%，P＝0.007）、更高的肝细胞癌发生率（32.6%vs 11.1%，P＝0.008）和病死率（45.7%vs 22.2%，P＝0.013）。HDV－4与HDV－2相似，较少造成严重临床后果。HDV－3引起的急性感染是造成南美洲暴发性肝炎的主要因素［36］。在撒哈拉以南的非洲患者中，HDV－5比HDV－1更易致使肝脏纤维化［37］。HDV不同基因型和基因亚型致病性存在差异的原因尚未完全阐明，可能与RNA复制编辑及病毒组装的效率相关［38－39］。

2.1 核酸印迹杂交 在PCR技术尚未发展的20世纪80年代，HDV RNA的检测主要依赖核酸印迹杂交。其检测流程是：抽提血清中的RNA，变性后直接转移至硝酸纤维素或尼龙膜，或通过变性琼脂糖凝胶电泳进行分离后转移固定到膜上，用HDV RNA探针（放射性同位素标记的HDV cDNA片段［40］或由体外转录HDV RNA［41］）杂交，洗膜后对其进行显影［42］。其优点是可以半定量检测HDV RNA，操作所需试剂仪器都易于取得，缺点则在于印迹杂交技术对于HDV RNA检测的灵敏度有限［41］。

2.2 逆转录聚合酶链式反应（RT－PCR）技术 第1篇关于PCR技术的文献［43］发表于1985年，其原理是在体外模拟遗传物质的天然复制，以微量的核酸模板扩增得到大量的特定DNA片段。PCR面世不久就被应用于HDV RNA的检测［41］，扩增产物可根据需要进一步进行核酸杂交或者测序，而随着PCR技术不断发展，HDV RNA检测的灵敏度和特异度也在不断提升。

常规反转录PCR：提取并纯化待测患者血液中的RNA成分，将其反转录所得cDNA作为扩增模板，选用一对HDV保守序列特异的引物，通过一定循环次数的变性、退火、延伸，获得所需片段的拷贝。Madejón等［41］用RT－PCR产物进行Southern印记杂交，发现常规PCR方法检测HDV RNA比狭缝杂交要灵敏10 000倍。

反转录巢式PCR（RT－nested PCR）：针对HDV RNA序列设计内外两对引物，外引物用于血清cDNA的第一轮PCR，扩增包含延伸侧翼区域的片段，第二轮PCR以第一轮PCR产物为模板，由内引物识别目标区域继续扩增。巢式PCR能提高扩增倍数同时减少非特异扩增，从而更加灵敏且特异地检测HDV RNA含量［44］。

实时反转录PCR（qRT－PCR）：qRT－PCR是指在PCR反应中加入荧光物质，通过在PCR过程中检测荧光信号来实时判断核酸扩增情况，而后通过Ct值和标准曲线对模板进行定量分析的方法。根据所用荧光物质的不同，qPCR方法主要分为染料法和探针法。染料法是利用荧光染料游离时不发光而结合于双链DNA小沟后发出荧光的特性，使得荧光信号强度随着PCR双链产物增加而成比增长，其优点是成本较低，缺点在于非特异性产物和引物二聚体也可引起荧光信号，特异性不足［45］。探针法则是利用荧光共振能量转移原理，探针上的报告荧光基团和淬灭荧光基团于PCR延伸阶段分离从而产生荧光信号，当探针设计良好时，此方法比染料法更为灵敏和特异，但成本也相对提高［46］。Yamashiro等［47］在2004年首次描述了应用SYBR Green荧光染料对HDV RNA进行RT－PCR定量方法，其对于合成HDV RNA片段的检出限为1000拷贝/mL。Le等［48］在2005年描述了利用Taqman探针检测HDV RNA的方法，对血清HDV RNA检出限为100拷贝/mL。目前应用于HDV RNA检测的主流荧光方案是Taqman探针，其次为Fret探针、分子信标以及SYBR Green染料［49］。

近些年HDV RNA实时反转录实验的流程和细节设计得到了不同维度的优化。一步法qRT－PCR使得cDNA合成与PCR扩增在同一管中相继完成，相比于分两步进行，简化工作流程、节约时间的同时降低了污染可能性。UDG酶和dUTP的应用有助于消除PCR残留核酸污染，降低实验样本的假阳性率。Wang等［50］针对HDV序列的两处保守片段设计了双靶标引物和探针，任一片段检测到阳性即判断该样本为HDV RNA阳性，理论上能够减少由于病毒变异所致的检测灵敏度下降，降低漏检的发生。高温变性后冷冻（95℃放置10 min后立即冷却至80℃）的方法被证实可以更好地破坏HDV RNA的二级结构，提高逆转录效率［51］。检测增强剂（detection enhancer）被认为可能有利于松弛二级结构以及扩增富含GC的核酸片段［18］。

反转录数字PCR（RT－dPCR）：数字PCR将待测样品随机分配到大量独立的反应单元中，每个反应单元分别单独进行核酸扩增后分析其荧光信号的有无，将判断结果按照泊松分布的原理进行统计分析从而得到靶分子的拷贝数及浓度。数字PCR可以实现对病毒核酸的绝对定量，其相对于qPCR灵敏度更高，具有耐受性好，标本用量少等优势；
但由于其系统复杂度增加且成本较高，目前尚未得到广泛应用。Olivero等［52］设计了使用ddPCR检测HDV载量的方法，同时用qPCR与其进行比较，结论是ddPCR方法检测HDV RNA具有媲美qPCR的精度与重现性，同时其最低定量限为qPCR方法的1/5。目前应用数字PCR对HDV RNA进行检测的文献屈指可数，未来仍需更多的研究来对该方法的性能进行评价。

2.3 环介导等温扩增技术（loop－mediated isothermal amplification，LAMP） LAMP是由Notomi等［53］在1998年设计的一种等温核酸扩增技术，在60℃～65℃的稳定温度下依赖2～3对特异性引物和链置换DNA聚合酶，持续循环合成DNA。其优势为速度快、操作简便、设备要求简单、裸眼观察浊度即可判读结果；
不足之处在于引物设计难度高且需要所有引物都与序列匹配才能扩增，而HDV易于变异，一套引物可能只能满足部分毒株的扩增需要［54－55］。Wang等［54］开发了用于HDV－1检测的RT－LAMP体系，认为此方法灵敏度不亚于常规RT－qPCR。

目前绝大多数实验室选择qRT－PCR方法对HDV RNA进行定量，选用的定量标准品主要包括质粒、体外转录的RNA、自制患者血清标准品、装甲RNA以及国际标准品。用含有HDV cDNA片段的质粒作为标准品的主要优点在于质粒稳定性佳，可重复性好，不足在于无法参与并监控RNA提取及逆转录过程。体外转录的HDV RNA能够参与核酸提取和逆转录，但因完全裸露而可能被环境中的核酸酶降解或受各类理化因素影响［47］，且亚基因组RNA与天然完整的HDV RNA的结构并不一致，也不具备病毒包膜，从而无法真正模拟临床样本中HDV病毒颗粒的裂解变性过程［51］。Homs等［51］建立了具有完整HDV基因组序列的RNA作为标准品，经过冻融仍保持稳定，或许能够在一定程度上模拟临床样本中HDV RNA的结构和行为。自制患者血清标准品是从高HDV病毒载量的慢性丁型肝炎患者体内获得的，其最大优势在于能够完整复刻真实样本的检测，不足之处则在于此类标准品中含有真实HDV颗粒而具有传染性，可能面临伦理问题，且无法大量供应［56］。装甲RNA是将目的RNA序列包裹到某种病毒外壳或其他蛋白外壳中构建而成，具有可耐受核酸酶、稳定性高、生物危险性低的特点，同时也能参与核酸提取、逆转录、扩增、检测的全过程，从而更好地完成质控，是较为理想的标准品选择［57］。但目前似乎尚无文献报道合成具有完整HDV基因组的装甲RNA，可能是因其具有一定的技术难度。以上四类标准品的共同缺点在于各实验室检测结果不具有可比性，为推进HDV RNA检测结果标准化，2013年WHO建立了第一批HDV RNA国际标准品［58］。该标准品是将患者血浆样本中分离得到的HDV－1型毒株以人源阴性血浆稀释后制成的冻干制剂。使用者自行将其用0.5 mL的无核酸酶水溶解后即可得到5.75×105IU/mL的标准血浆，该浓度是由多中心分别进行实时荧光定量PCR协作定值。但因其获取困难、价格昂贵，目前尚未得到全面普及。

长期以来，人们对HDV感染的临床认识普遍不足，加之缺乏标准而可及的检测方案和试剂，导致HBsAg阳性人群中HDV检测率严重低下，丁型肝炎诊断多有遗漏。临床上广泛用于治疗慢乙型肝炎的核苷（酸）类似物对HDV感染并无改善作用［59］，丁型肝炎诊断不足无形之中带来巨大疾病负担。

目前国际上以RT－PCR为主流的HDV RNA检测方案持续优化，灵敏度、特异度都在不断提高，高通量、自动化更是大势所趋。现有的不少HDV RNA检测方法对HDV－1反应良好，对其他基因型的检测能力却相对低下，原因之一在于HDV RNA序列的异质性对引物和探针的保守性提出了更高的要求，其次在于HDV序列易自身折叠形成复杂结构从而影响反转录和扩增的效率［49］。为了增加检验的灵敏度，理想的引物和探针应设计于高度保守的区域，同时要考虑到RNA二级结构对反转录的影响。HDV国际标准品的出现使得对定量结果进行校正成为可能，但目前只有HDV－1基因型，希望其未来可以继续推出其他7种基因型HDV标准品，使得各方法对于血液HDV RNA含量的测定能力得以全面准确评价。普及丁型肝炎感染知识，在HDV易感人群中全面开展血HDV RNA检测，对推动丁型肝炎早诊早治，降低丁型肝炎疾病负担具有重大意义。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：林妍雪负责查阅文献和撰写文章；
秦艳丽负责修改文章；
张继明负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。