HPLC同时测定槐榆止血合剂中4种黄酮苷类成分含量

杨军辉，蒋 赢，俞 宾，陈国宝，袁 保，黄和军，徐艺铨

（江阴市中医院，江苏 江阴 214400）

槐榆止血合剂是江苏省江阴市名中医缪建辉主任中医师临床经验方，由槐花、地榆、陈皮、枳壳等7味药组方，具有止血补血，行气润肠之功效，临床用于治疗血热肠燥所致痔疮、肛裂出血，肠风下血、肠燥便秘。槐榆止血合剂主要活性成分为黄酮和鞣质。槐花为方中君药，其主要化学成分为黄酮苷类成分芦丁，具有清热止血与凉血止血功效，临床常用于治疗痔疮出血[1-2]。枳壳-陈皮为经典药对，主要含有黄酮苷类化合物如橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷等，具有行气通便作用，可缓解痔疮引起的便秘[3-4]。

中药合剂作为多组分复杂体系，单一指标成分难以全面评价合剂的制剂质量[5-6]。本研究采用高效液相色谱法（HPLC）同时测定制剂中4种主要黄酮苷类成分含量，为槐榆止血合剂的院内质控提供参考依据。

1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪，配置VWD可变波长紫外检测器（Agilent）；
XP-6型百万分之一天平（Merrler Toledo）；
KQ-5200DE型超声清洗机（昆山超声仪器公司）；
TGL-16G型高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.2 试药

芦丁对照品（批号：100081-201811，纯度：91.7 %）；
柚皮苷对照品（批号：110722-201815，纯度：91.7 %）、橙皮苷对照品（批号：110721-202019，纯度：95.3 %）、新橙皮苷对照品（111857-201804，纯度：99.4 %）均购自中国食品药品检定研究院。槐榆止血合剂（批号：20210510，20210511，20210512）、槐花阴性样品、枳壳和陈皮双阴性样品均由江阴市中医院制剂室生产。甲醇、乙腈（色谱纯，Tedia公司），水为娃哈哈纯净水；
磷酸为分析纯（南京化学试剂公司）。

2.1 色谱条件

色谱柱：Sepax C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；
流动相：乙腈（A）-0.2 %磷酸（B），梯度洗脱（0～20 min，14 %～16 %A；

20～53 min，16 %～30 %A；
53～58 min，30 %～14 %A；
58～60 min，14%A）；
流速：1 ml/min；
检测波长：283 nm；
柱温：35 ℃。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 分别精密称取适量的芦丁、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷对照品，用甲醇溶解，制成浓度分别为206.3，131.1，117.2，134.2 μg/ml的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 精密量取1 ml合剂，置入50 ml量瓶，用甲醇定容，超声（功率250 W，频率50 kHz）10 min，放冷后摇匀，离心（12000 r/min，10 min），取上清滤过，以续滤液作供试品溶液。

2.2.3 阴性样品溶液 按照槐榆止血合剂标准工艺生产，制备缺槐花、枳壳和陈皮双阴性样品，按2.2.2项方法处理而得。

2.3 专属性试验

分别吸取混合对照品溶液、槐榆止血合剂供试品溶液、槐花阴性样品溶液及枳壳和陈皮双阴性样品溶液各10 μl，按照2.1项方法检测，各样品色谱图见图1。结果表明，4种黄酮苷类成分与相邻峰的分离度均＞1.5，阴性样品无干扰，表明检测方法专属性良好。

图1 各成分HPLC色谱图

2.4 线性关系考察

取混合对照品溶液，依次用甲醇逐级稀释制成6个不同浓度的线性关系考察溶液，分别吸取10 μl，按2.1项方法检测，记录色谱图。以各黄酮苷浓度为横轴（X），相应峰面积为纵轴（Y），绘制标曲并生成线性方程，结果见表1。由表1可见，4种黄酮苷类成分各自的线性关系良好。

表1 各成分线性关系

2.5 精密度试验

精密吸取线性关系考察中的同一个混合对照品溶液10 μl，按2.1项方法连续进6针，记录各黄酮苷类成分色谱峰峰面积，经测算芦丁、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷峰面积RSD依次为1.42 %，2.30 %，1.46 %，1.70 %，表明仪器的精密度良好。

2.6 重复性试验

取同一批槐榆止血合剂（批号：20210511），按2.2.2 项方法平行处理6份，按2.1项方法进样测定，经测算芦丁、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷含量RSD依次为1.74 %，0.40 %，0.33 %，2.14 %，表明该法重复性良好。

2.7 稳定性试验

取同一批槐榆止血合剂（批号：20210511），按2.2.2项方法处理，置于室温条件下，分别于0，2，4，8，12，24 h时按2.1 项方法进样测定，经测算芦丁、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷峰面积RSD依次为1.93 %，0.49 %，0.47 %，1.53 %，表明供试品溶液在室温下放置24 h内基本稳定。

2.8 加样回收率试验

精密量取已知含量的槐榆止血合剂（批号20210511）0.5 ml，平行6份，加入同等含量的对照品溶液适量，按2.2.2项方法处理，再按2.1项方法进样测定，计算4种黄酮苷类成分的加样回收率，结果见表2。

表2 各成分加样回收率试验结果（n=6）

2.9 含量测定

取3批槐榆止血合剂（批号：20210510，20210511，20210512），按2.2.2项方法平行处理3份供试品溶液，按2.1项方法进样测定，计算4种黄酮苷类成分含量，结果见表3。

表3 各成分含量测定结果（n = 3）/mg·ml-1

3.1 流动相选择

参考2020年版中国药典及文献[7-8]，预试验阶段分别考察了乙腈和甲醇作为有机相，以及甲醇-1 %冰醋酸溶液和乙腈-0.2 %磷酸溶液等多个流动相对4种黄酮苷类成分分离效果的影响，系统适用性结果表明，乙腈-0.2 %磷酸溶液作为梯度洗脱的流动相时，4种黄酮苷类成分分离度良好，峰形较好。

3.2 检测波长选择

芦丁有257 nm和360 nm两个吸收波长，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷3种成分吸收波长均在283 nm[9-11]。前期发现如将257 nm或360 nm定为检测波长，对柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷3种成分的色谱峰响较低，且槐榆止血合剂中这3种成分含量低于芦丁，可能影响测定结果的准确性，故最终设定283 nm作为检测波长，此条件下4种黄酮苷类成分均有较强的吸收。

本试验建立了同时测定槐榆止血合剂中4种黄酮苷类成分芦丁、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷含量的HPLC方法，该法简便准确、重复性好，可为槐榆止血合剂的质控提供试验依据。