UPLC-MS/MS同时快速检测清咽类制剂25种化学药物的方法

周 颖，黎 强，陈立波，陈 洁，李冬云

（1.玉林市食品药品检验监测中心，广西 玉林 537000；
2.玉林中药材（含香型料）质量检测与评价工程技术研究中心，广西 玉林 537000）

近年，有不法分子向凉茶制品、润喉糖等改善咽喉不适的食品中添加化学药物，达到快速有效地缓解咽喉不适的目的，广西、广东等地陆续有多起凉茶中非法添加对乙酰氨基酚、土霉素等化学药物的报告和案件[1-2]，严重影响人体健康和产业健康发展[3]。

根据一定范围的市场调研及查阅文献[4-11]发现，宣称清热解毒、消炎利咽的制剂有添加化学药物的可能，目前发现的药物以非甾体解热镇痛药、激素、抗菌药和中枢兴奋剂等，种类复杂。宋宁宁等[9]建立QuEChERS-UPLC-MS/MS测定凉茶中12种化学药物的方法；
韩婉清等[10]采用SPE-UPLCMS/MS测定凉茶15种植物源性兴奋剂和外源性药物。以上研究中未覆盖颗粒剂、茶剂、果脯、润喉糖等不同剂型清咽类产品，而这类剂型的产品也越来越受消费者欢迎。本文以添加适应症吻合、价廉易得、临床应用广泛的25种化学药物作为研究对象，采用超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）快速筛查非法添加药物，本方法便捷、重复性好、检测准确、耐用性高，为清咽类制剂的监督检验提供技术支持。

1.1 仪器

Xevo-TQ-Smicro高效液相-质谱联用仪（Waters ACQUITY H-Class PLUS四元系统，Empower色谱工作站，美国Waters公司）；
XS-205DU电子分析天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）。

1.2 药品与试剂

对乙酰氨基酚（批号：100018-201610，含量：99.9 %）、安替比林（批号：100506-200301，含量：100.0 %）、氨基比林（批号：100503-200301，含量：100.0 %）、沙丁胺醇（批号：100204-201103，含量：99.7 %）、氢溴酸右美沙芬（批号：100201-201003，含量：95.1 %）、头孢他定（批号：130484-200502，含量：84.2 %）、马来酸氯苯那敏（批号：100047-201507，含量：99.7 %）、盐酸克仑特罗（批号：100072-200402，含量：100.0 %）、双氯芬酸钠（批号：100334-201803，含量：100.0 %）、保泰松（批号：100481-200601，含量：99.9 %）、富马酸酮替芬（批号：100230-201904，含量：99.8 %）、磷酸苯丙哌林（批号：100237-200702，含量：99.8 %）、盐酸二氧丙嗪（批号：10299-0001，含量：100.0 %）、青霉素（批号：130437-200603，含量：88.8 %）、乙酰螺旋霉素（批号：130347-200403，含量：78.3 %）、头孢泊肟酯（批号：130517-200802，含量：73.6 %）、红霉素（批号：130307-200716，含量：93.5 %） 、麦迪霉素（批号：130337-9803，含量：95.9 %）、交沙霉素（批号：130359-200301，含量：100 %）、罗红霉素（批号：130557-200502，含量：94.1 %）、阿司匹林（批号：100113-200603，含量：100.0 %）、茶碱（批号：100121-201104）、尼美舒利（批号：100555-200501，含量：100.0 %）、吲哚美辛（批号：100258-200904，含量：99.9 %）、头孢呋辛酯（批号：130492-200402，含量：80.8 %）均购自中国食品药品检定研究院；
甲醇、乙腈为色谱纯（美国Fisher，色谱纯）；
氯化钠、乙酸为国药集团化学试剂有限公司；
实验用水为自制超纯水。

1.3 样本来源

本文研究中使用的凉茶、润喉糖、颗粒剂、蜜饯类产品，收集于广西、广东各县市市售以及市监督抽检样品，涵盖有现场制作销售的凉茶、清咽类蜜饯和预包装产品共计110批，其中样品编号1～89为市售凉茶，编号90～110为润喉糖、颗粒剂、蜜饯类等。根据市售凉茶、清咽类蜜饯等配方，选取常用的中药材作为制备空白基质溶液的品种，均采购于玉林市银丰中药材市场，经玉林市食品药品检验检测中心中药室鉴定为正品。

2.1 色谱条件

色谱柱：CAPCELL CORE C18（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）分离，以水-甲醇-0.025 %乙腈系统为流动相梯度洗脱；
流动相A相为水，B相为甲醇，C相为含0.025 %甲酸的乙腈溶液梯度洗脱（见表2）；
流速0.25 ml/min；
柱温：35 ℃；
进样量5 μl。梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

2.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源（electro-spray ion，ESI），电离模式：正离子模式、负离子模式；
检测方式：多反应监测（multi reaction monitoring，MRM）模式；
毛细管电压 （kV）：2.50；
锥孔电压 （V）：30.00；
离子源温度 （℃）：150；
脱溶剂气体温度 （℃）：500；
锥孔气流量 （L/Hr）：20；
脱溶剂气体流量 （L/Hr）：1000。

25种非法添加药物的质谱参数见表2，总离子流图见图1。

图1 25种非法添加药物的总离子流图

2.3 样品溶液的制备

精密称取/量取1.3项下的样品 0.20 g/0.20 ml（固体研磨成粉碎，液体样品振摇均匀）置入15 ml离心管，加入1 ml饱和氯化钠溶液，涡旋30 s使分散，精密加入0.5 %甲酸的乙腈溶液5 ml，涡旋30 s，超声提取30 min，10 000 r/min离心5 min，吸取上清置入10 ml量瓶，加50 %乙腈（含0.5 %甲酸）水溶液定容至刻度，摇匀，提取液过0.22 μm滤膜，待测。若样品中待测成分浓度超出曲线范围，用50 %乙腈适当稀释。

2.4 空白基质溶液的制备

取生地、大青叶、板蓝根、麦冬、知母、薄荷、桑叶、牡丹皮、石斛、女贞子、甘草中药材各2～10 g，加清水500 ml大火煎煮烧开后，小伙熬制30 min，制成约100 ml的空白基质溶液，放凉，用滤纸滤过。

2.5 基质匹配标准曲线的配制

2.5.1 对照品储备溶液配制 精密称取各对照品10 mg，其中头孢他定、头孢泊肟酯，头孢呋辛酯、青霉素置于10 ml量瓶，沙丁胺醇、氢溴酸右美沙芬、盐酸克仑特罗、富马酸酮替芬、苯丙哌林、二氧丙嗪、乙酰螺旋霉素、红霉素、麦迪霉素、交沙霉素、罗红霉素置于50 ml量瓶，其余对照品分别置于各20 ml量瓶中，加乙腈适量（沙丁胺醇和盐酸特伦特罗加适量水溶解）振摇使溶解，并稀释至刻度，摇匀即得。

2.5.2 混合对照品储备液配制 精密量取上述各单标溶液头孢他定0.4 ml、头孢泊肟酯0.2 ml、头孢呋辛酯0.2 ml、青霉素0.2 ml、沙丁胺醇0.1 ml、氢溴酸右美沙芬0.2 ml、盐酸克仑特罗0.1 ml、富马酸酮替芬0.2 ml、苯丙哌林0.1 ml、二氧丙嗪0.1 ml、乙酰螺旋霉素0.4 ml、红霉素、麦迪霉素、交沙霉素、罗红霉素各0.2 ml，其余对照品各0.16 ml置入同一20 ml量瓶，用50 %的乙腈（含0.5 %甲酸）水溶液稀释至刻度，摇匀即得。

2.5.3 混合对照品标准曲线配制 分别精密量取上述混合对照品储备液各0.025，0.05，0.10，0.15，0.20，0.25 ml，分别置入 15 ml离心管，加入制备好的空白基质溶液0.2 ml，按2.3项方法制备混合对照品标准曲线，用50 %乙腈（含0.5 %甲酸）水溶液定容至10 ml，照2.1和2.2项方法进样测定。

3.1 标准曲线

按照2.5.3项的测得结果，以25种化学药物成分的进样浓度为X，对应的峰面积为Y，得25种化学药物的标准曲线，结果见表3。

3.2 系统适应性考察

3.2.1 精密度 取2.4项下空白基质溶液0.2 ml，加入2.5.2项下混合对照品储备液0.05 ml，置入15 ml离心管，按2.3项方法制备精密度溶液，加50 %乙腈（含0.5 %甲酸）水溶液定容至10 ml，连续进样6次测定。结果表明，25种化学药物的RSD为0.23 %～1.52 %，可见仪器的精密度良好。

3.2.2 重复性 取2.4项下空白基质溶液6份各0.2 ml，加入2.5.2项下混合对照品储备液0.05 ml，置入15 ml离心管，按2.3项方法制备重复性溶液，加50 %乙腈（含0.5 %甲酸）水溶液定容至10 ml，连续进样6次测定。结果表明，25种化学药物的RSD为0.23%～1.52%，可见仪器的精密度良好结果表明，25种化学药物的RSD为1.01 %～2.24 %，可见方法的重复性良好。

3.2.3 稳定性 取2.4项下空白基质溶液0.2 ml，加入2.5.2项下混合对照品储备液0.05 ml，置入15 ml离心管，按2.3项方法制备稳定性溶液，加50 %乙腈（含0.5 %甲酸）水溶液定容至10 ml，在0，2.0，4.0，6.0，8.0，12.0，24.0 h分别进样测定，以25种化学药物成分峰面积为指标，测定其稳定性。结果表明25种化学药物的稳定性RSD为1.75 %～3.07 %。表明各成分均在24 h内稳定。

3.3 检出限与定量限

以2.5.3项下混合对照品标准曲线配制的最低点浓度标准溶液稀释20倍后，重复测定6次，以信噪比S/N≥3确定检测下限（LOD），以信噪比S/N≥10确定定量下限（LOQ），结果见表3。

3.4 加标回收率

取空白基质溶液9份，分别添加3个不同浓度混合对照品储备液0.025，0.10，0.20 ml各3份，按照2.3项下制备的样品溶液，平行测定6次，结果表明，采用本方法检测的25种化学药物的回收率范围为75.80 %～111.11 %，RSD（n=6）在0.78 %～3.41 %。其中盐酸特伦特罗、头孢拉定的回收率较低。线性回归方程，线性范围、相关系数结果见表3。

3.7 抽检样品测定

应用本法测定市售产品中25种化学药物，结果在凉茶中有各种化学药物的检出，而颗粒剂、茶剂、果脯、润喉糖中均未检出。有检出样品的情况见表4。

4.1 色谱柱的选择

本实验考察了Agilent SB-C18、Agilent InfinityLab Poroshell 120 SB-C18、CAPCELL PAK C18（IF2）、及CAPCELL CORE C18这4种型号的色谱柱，对25种化合物进行分离，结果发现Agilent SB-C18出峰峰型好，但是头孢类成分未能很好分离，Agilent InfinityLab Poroshell 120 SB-C18还不及Agilent SB-C18的分离效果，CAPCELL PAK C18（IF2）各成分基本能分离，但是头孢类峰型差，CAPCELL CORE C18出峰峰型较好，响应高，各成分分离较好，故本实验选择CAPCELL CORE C18色谱柱进行分离。

4.2 流动相选择

流动相的组成和比例直接影响物质的分离，灵敏度[12]。本实验要求的流动相既要达到分离25种化合物的效果，还要保证离子化效率，以满足质谱的监测，在流动相中加入挥发性有机酸可提高离子化效率，同时也利于样品的溶解。由于甲酸相对分子量小，酸性较乙酸强，更有利于离子化和质谱的解析[13]。故考察多种流动相系统，其中采用0.1 %甲酸水-甲醇和0.1 %甲酸水-乙腈系统[14]，经过实验发现加入乙腈流动相比甲醇的出峰较快，但是头孢类和个别青霉素不出峰或者峰型差，负离子模式相应较低。采用水-甲醇-含0.025 %甲酸的乙腈溶液系统，正负离子响应良好，且大部分头孢类成分可成峰，目标化合物能较好实现分离。最终采用水-甲醇-0.025 %乙腈溶液系统梯度洗脱，结果见表1。

4.3 子离子选择性及碰撞能优化

根据25种化学药物的理化性质及母离子，采用正离子监测方法对这25种对照品溶液进行MS/MS分析，首先进行一级扫描，对母离子进行筛选，优化毛细管电压、锥孔电压、离子源温度，脱溶剂气温度、脱溶剂流量了等质谱参数，再施加一定量的碰撞气，对母离子进行子离子扫描获得响应的子离子峰。选择丰度强，干扰小的离子作为定量和定性离子，得到优化后优化锥孔电压和碰撞能量，结果见表2。

4.4 空白基质溶液的选择

根据市售凉茶以及宣称清咽类产品的中药配方，本实验选取其中通常选用的中药材，其均有清热解毒、润肺凉血等功效，借鉴此类制剂传统的清水煎煮的方式，制备空白基质溶液进行系统适应性实验，以减少样品测定过程中的基质干扰影响。

本方法通过采用液相色谱仪串联质谱法，在20 min内对清咽类凉茶、颗粒剂、茶剂、蜜饯、润喉糖中25种成分进行快速定量定性分析。经筛查110批样品，发现凉茶、梨膏糖、蜜饯类均有非法添加化学药物的情况，特别是凉茶中，添加对乙酰氨基酚、马来酸氯苯那敏、阿司匹林、红霉素情况较多。（1）对乙酰氨基酚的添加浓度多数达到2～10 mg/g；
（2）多数检出情况存在同时非法添加两种以上化学药物，个别甚者同时添加5种药物；
（3）在89批的凉茶中，检出有非法添加化学药物的样品24批，检出率为27 %，在20批的其他制剂中检出有化学药物的样品3批，检出率为14 %，均为梨膏糖、润喉糖。

本方法考察的样品均为市售品种，是消费者食用的普通食品，目前市场上品种繁多，民众无法按剂量服用，容易导致重复用药，过量用药，同时也给监管带来盲区。本方法提取方便，准确度高，精密度，耗时短，在实际应用中可高效的对此类清咽类制剂中非法添加化学药物进行快速确证筛查。