QuEChERS-气相色谱/质谱法测定牛奶中氟虫腈及其代谢物的残留量

张 仙， 胡西洲， 张隽娴

(湖北省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，湖北武汉 430064)

氟虫腈(Fipronil)又名芬普尼、锐劲特，它是法国罗纳普朗克公司于1981开发生产的一种高活性且应用广泛的苯基吡唑类光谱杀虫剂[1]。氟虫腈可通过氧化还原和水解过程降解，产生代谢产物氟甲腈、氟虫腈砜和氟虫腈硫醚。氟虫腈代谢物在人体中的保留时间比母体更长，毒性更强[2,3]，人食用含有一定浓度的氟虫腈食品，会损伤肾脏和肝脏，世界卫生组织将其列为“对人类有中度毒性”的化学品[4]。氟虫腈及其代谢物对环境及人类健康的影响受到了很多国家的关注，并对其使用及残留量作出了明确规定，欧盟和日本规定了牛奶中氟虫腈的限量值分别为0.005和0.02 mg/kg[5,6]。我国国家标准(GB 2763-2021)《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》中明确规定了牛奶中氟虫腈最大残留限量为0.02 mg/kg[7]，但此标准并未规定氟虫腈的检测方法，国内也尚未制定乳制品中氟虫腈残留量检测的相关标准。

目前，氟虫腈及其代谢物的检测方法主要有气相色谱法[8,9]、气相色谱/质谱联用法[10]、液相色谱法[11]和液相色谱/质谱联用法[12,13]。但这些检测方法主要是针对氟虫腈原药、植物源性产品、环境水体中的氟虫腈及其代谢物残留检测，采用气相色谱/质谱法检测牛奶基质中的氟虫腈及其代谢物的相关报道较少。张小刚等[14]建立了一种固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法同时测定牛奶中氟虫腈及其代谢物的分析方法；
王永芳等[15]利用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法测定牛奶中氟虫腈及其代谢物残留量；
罗彤等[16]利用气相色谱-负化学源质谱(GC-NCI-MS)测定牛奶中氟虫腈及其3种代谢物残留量等。本实验将QuEChERS法与气相色谱/质谱法相结合，建立了一种简便、快速、准确测定牛奶中氟虫腈及其代谢物残留量的分析方法。该方法通过将合适的固体吸附剂加入样品提取液中，达到除去基质中的干扰物和对目标组分的提取和净化的目的，具有简单快速、试剂用量小、检测范围广、高效等优点，可满足快速处理大批量农药残留样品的需求。为牛奶中氟虫腈及其代谢物残留量的快速检测提供技术支撑。

1.1 主要仪器与试剂

Agilent 6890A-5975C型气相色谱/质谱仪(美国，Agilent公司)，配备电子轰击源(EI)；
CMVC涡旋振荡仪(德国，Sartorius股份公司)；
BSA2202S型电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；
KQ-500B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；
氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈硫醚、氟虫腈砜标准物质均购于农业农村部环境质量监督测试中心，质量浓度为1 000 μg/mL。甲醇、乙腈、丙酮(色谱纯，美国Baker公司)；
无水MgSO4、无水NaAc(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；
N-丙基乙二胺填料PSA购于上海安谱实验科技股份有限公司。

牛奶购于便利超市。

1.2 样品前处理

1.2.1 提取准确称取15.00 g(精确至0.01 g)牛奶样品于50 mL具塞塑料离心管中，加入15 mL冰HAc-乙腈溶液，涡旋振荡3 min，水浴超声提取20 min，加入6.0 g无水MgSO4和1.5 g无水NaAc，涡旋混匀2 min后，5 000 r/min离心3 min。

1.2.2 净化准确称取0.25 g PSA、0.75 g无水MgSO4置于10 mL塑料离心管中，准确吸取5.0 mL上清液至此离心管中，涡旋振荡2 min，以5 000 r/min离心3 min。取1 mL上清液，过0.22 μm有机微孔滤膜后，供气相色谱/质谱测定。

1.3 仪器条件

色谱条件：色谱柱，DB-5MS毛细管柱，30 m×0.25 mm×0.25 μm；
色谱柱温度程序：90 ℃保持1 min，然后以12 ℃程序升温至290 ℃，保持20 min；
进样口温度320 ℃；
色谱/质谱接口温度270 ℃；
载气，氦气，纯度≥99.999%，流速1.0 mL；
进样量1 μL；
进样方式，不分流进样，溶剂延迟，11.0 min。

质谱条件：EI源，70 eV；
离子源温度260 ℃。SIM模式：每个化合物选择1个定量离子和2个定性离子，4种化合物的保留时间、母离子、子离子见表1。氟虫腈及其代谢物标准品先用丙酮稀释至100 μg/mL，保存于-18 ℃冰箱内，再分别用空白牛奶基质溶液配制成 0.010 0、0.100 0、0.150 0、0.200 0、0.500 μg/mL的混合标准工作液，现配现用。

表1 氟虫腈及其代谢物的保留时间、母离子和子离子

2.1 提取溶剂的选择

由于氟虫腈及其代谢物属于弱极性的化合物，在不同的有机溶剂中有着不同的溶解度，本实验选用了甲醇，乙腈，1%酸化乙腈为提取溶剂，在阴性牛奶样品中添加氟虫腈及其代谢物的混合标准溶液，添加水平为0.01 mg/kg，按照“1.2”进行提取净化，“1.3”进行分析，结果见图1。可以看出当使用甲醇作为提取溶剂时，4种化合物的回收率仅为26.4%～47.7%；
使用纯乙腈提取时，4种化合物的平均提取率仅为78.4～80.6%；
1%酸化乙腈提取时，回收率均可达到83.0%以上。这可能是由于氟虫腈及其代谢物属于弱碱性化合物，更易溶于酸性溶剂，且乙腈的极性强，有沉淀样品中蛋白质作用，能减少脂肪及其他杂质的溶出从而减少了基质对目标物的干扰。本实验选用1%酸化乙腈作为提取溶剂。4种化合物混合标准溶液的总离子流色谱图见图2。可以看出，氟虫腈及其代谢物均有较高的响应强度，且分离效果良好。

图1 3种提取溶剂对氟虫腈及其代谢物回收率的影响Fig.1 Effects of three extraction solvent on the recovery of the fipronil and its metabolites

图2 氟虫腈及其代谢物混合标准溶液总离子流色谱图Fig.2 Total ion chromatograms of fipronil and its metabolites1.Fipronil desulfinyl,2.Fipronil sulfide,3.Fipronil,4.Fipronil sulfone.

2.2 净化条件的优化

牛奶基质中主要成分是水，还含有很多脂肪、磷脂、蛋白质、乳糖等成分，这些物质的存在会对目标化合物的检测产生干扰，从而影响测定结果的准确性，经过乙腈提取后需通过净化去除这些杂质的干扰，才能使得目标物分离的更好，同时也能减少杂质对仪器的污染。结合牛奶基质特性以及氟虫腈类化合物的理化性质，本实验比较了Florisil固相萃取柱、氨基-石墨化炭黑复合柱和经典的QuECHERS法对样品的净化，对加标0.1 mg/kg混合标准溶液的牛奶提取液进行净化比较回收率，从回收率高低、净化所需时间、耗材的成本进行综合评价，结果显示Florisil固相萃取柱回收率偏低，QuEChERS法和氨基-石墨化炭黑复合柱的回收率相当，但氨基-石墨化炭黑复合柱操作过程复杂，耗费时间较长且活化洗脱柱子耗费有机试剂较多对环境污染较大，而QuEChERS法操作过程简单快速且回收率能到到要求，综合以上考虑，选用QuECHERS法对提取液进行净化。三种净化方法的回收率结果如图3所示。

图3 牛奶中氟虫腈及其代谢物不同净化方式的回收率Fig.3 Recoveries of fipronil and its metabolites in milk by different purification methods

2.3 方法评价

2.3.1 线性范围和方法检出限依次测定0.01、0.10、0.15、0.20、0.50 μg/mL的混合标准工作液，以氟虫腈及其代谢物的峰面积(y)对其质量浓度(x)绘制其线性工作曲线，这4种农药在0.01～0.50 μg/mL的范围内线性关系良好，相关系数R2>0.997。0.01 μg/mL标准溶液连续进样6次，以3倍和10倍信噪比(S/N)确定各化合物的检出限(LOD)和定量限(LOQ)，结果见表2。氟虫腈及其代谢物的检出限为0.30～0.68 μg/kg，定量限为0.90～1.20 μg/kg。

表2 4种化合物的线性方程、相关系数(R2)、检出限(LOD)及定量限(LOQ)

2.3.2 方法回收率和精密度取15.00 g 阴性牛奶样品，添加0.010、0.100、0.500 mg/kg 3个水平的氟虫腈及其代谢物，每个水平做6个平行样，按照“1.2”进行样品前处理，按“1.3”进行测定，结果见表3。4种化合物平均回收率在83.7%～112.6%，精密度RSD在1.8%～4.2%，均满足国标(GB/T 27404-2008)《实验室质量控制规范食品理化检测》对方法技术参数的要求。

表3 加标牛奶中4种化合物的平均回收率和RSD(n=6)

2.3.3 基质效应的考察样品在分析过程中，受基质效应的影响，目标化合物会发生离子增强或减弱效应，从而影响测定结果的准确性。本实验以基质匹配校准曲线的斜率/溶剂标准曲线的斜率考察不同化合物的基质效应，比值越接近1，则基质效应越小[17]。比较纯溶剂丙酮和牛奶基质空白配制的标准溶液的基质效应，氟虫腈及其代谢物的基质效应在98.7%～106.3%之间。说明了本实验的净化方法具有较好的净化效果。为了更准确的测定目标化合物降低基质效应的影响，本实验采用基质匹配标准曲线进行定量测定。

2.4 方法比较

将本实验所建立的QuEChERS-气相色谱/质谱法与目前已有的关于乳制品中氟虫腈及其代谢物残留量的检测方法[14 - 16]进行比较，包括提取溶剂、净化方法、检出限、平均回收率等。结果如表5所示，相比其他方法，本方法的检出限与文献报道的LC-MS/MS检测方法相当，且操作简单快速，样品前处理过程中所需试剂和耗材较少，成本低污染小，具有良好的操作性和实用性。

表5 与已有其他方法的比较

2.5 实际样品的测定

采用本实验建立的检测方法对市场上 30个牛奶样品进行测定，所有样品均未检出氟虫腈及其他三种代谢物。

本实验利用QuEChERS前处理方法，结合GC/MS，建立了针对牛奶中氟虫腈及其他三种代谢物残留的检测方法，并对提取条件、净化条件进行了优化，对基质效应及方法学进行了考察。经方法学验证，该方法的回收率、精密度、线性、定量限、检出限等均满足农药多残留检测技术的要求。该方法提取效率高、净化速度快、前处理简单快速、易于操作，可大大节省检测时间，适合大批量样品的快速筛查；
检测成本低，不需要固相柱净化，节省了耗材及试剂；
整个过程对环境污染也较小。目前国内还没有乳制品中氟虫腈及其代谢物残留量检测的相关标准，该方法的建立可以为后期我国建立相关标准提供检测方法和数据参考，也可以为安全监管部门提供技术支持。