一种方酸菁染料的聚集体调控及其在Pb2+检测中应用

张秀凤， 刘 璐,， 石 磊， 赵树华,3， 赵 晗， 丁春光， 于丽佳*

(1.华北理工大学化学工程学院，河北唐山 063210；
2.国家卫生健康委职业安全卫生研究中心，北京 102308；
3.有机功能分子合成与应用教育部重点实验室(湖北大学),湖北武汉 430062)

铅在自然界广泛存在，它是毒性最强的重金属元素之一[1]。铅在环境中大多以化合物的形式存在，稳定性强，不易降解，主要应用于蓄电池、冶金和化工等行业[2,3]。环境中的铅能够通过呼吸、消化等方式进入人体，可对人的神经、消化和骨髓造血等系统造成损伤[4,5]。与成人相比，幼儿的身体器官还未发育成熟，因此对铅更加敏感，长时间接触铅会造成智力低下，免疫力降低等症状[6]。目前，检测重金属离子的传统方法主要是原子吸收光谱法[7]、原子荧光光谱法[8]以及电化学分析法[9]等。这些方法灵敏度高，准确性好，但是大都需要专业的技术人员和昂贵的设备仪器[10]。紫外光谱仪具有成本低、操作方便的优势。尤其是近些年来，便携式紫外光谱方法的发展，使得基于紫外光谱检测重金属方法越来越受到人们的重视。

核酸适配体是一段具有三维空间结构的寡核苷酸序列，与配体特异性结合，具有很高的亲和力和稳定性[11]。基于核酸适配体构建重金属检测方法受到研究人员的青睐[12]。我们课题组前期设计合成了一些单甲川菁染料和三甲川菁染料，利用核酸适配体构建了Pb2+检测方法，具有较好的特异性[13 - 15]。但是单甲川菁染料和三甲川菁染料的光谱信号和文献中报道的一些探针一样，大都是位于紫外-可见区域，其激发和发射对于生物体具有一定的损伤(表1)。近红外区域的方酸染料组织穿透性增强，细胞损伤降低[18]。本研究合成了一种方酸类菁染料F-Cl，其吸收信号接近近红外区域，结构具有稳定的共振两性离子特征，磺酸基团和季胺盐部分提高了F-Cl的溶解性；
氯原子的修饰增加了自身聚集能力[13]。F-Cl在溶液中可形成二聚体和单体，本研究以G-四链体为模板，利用单体和二聚体对其亲和力不同，构建了一种基于紫外-可见吸收光谱检测Pb2+体系。

表1 不同探针的Pb2+检测波长和检测限

1.1 主要仪器与试剂

UV 3600 Plus型紫外-可见分光光度计(日本，岛津公司)；
WFH-2048型手提式紫外分析仪(杭州齐威仪器有限公司)；
FX-016型漩涡振荡器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；
D1008型离心机(大龙兴创实验仪器(北京)有限公司)。

5-氯-2-二甲基苯并噻唑(>98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；
1,3-丙磺内酯(>98%，梯希爱(上海)化成工业发展有限公司)；
方酸(98%,上海皓鸿生物医药科技有限公司)；
丙酮、乙醚(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；
正丁醇(>99.8%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；
吡啶(分析纯，河北百灵威超精细材料有限公司)；
Pb2+适配体T30695(5′-GGGTGGGT-GGGTGGGT-3′，上海生工生物工程股份有限公司)；
Pb2+，Cd2+(标准溶液：1 000 μg/mL，中国计量学院)；
超纯水(≥11.4 ΜΩ·cm(25 ℃)，Millipore公司)。

1.2 Pb2+的检测原理

G-四链体是富含鸟嘌呤(G)的单链序列，在金属离子存在下，富G序列形成DNA二级结构G-四链体，实现空间构型的改变。单链和G-四链体对于不同聚集状态具有不同的亲和力。低浓度方菁染料F-Cl在超纯水中主要以单体形式存在，高浓度F-Cl则更容易堆积成二聚体。T30695是一种Pb2+敏感的核酸适配体，无Pb2+时，以单链形式存在；
加入Pb2+后，形成G-四链体。如图1所示，在Pb2+存在下，T30695单链形成G-四链体，将体系中F-Cl的二聚体解聚成单体；
无Pb2+时，二聚体不会被解聚。以二聚体和单体的转化能力差异，实现Pb2+检测。

图1 (a)F-Cl化学结构式[13]和(b)Pb2+检测原理图Fig.1 (a) The chemical structure of F-Cl;(b) Schematic diagram of Pb2+ detection mechanism

1.3 实验方法

1.3.1 F-Cl方菁染料的合成F-Cl方菁染料的合成采用于等人[13]的方法(图2)，将化合物1与1,3-丙磺内酯在115 ℃回流7 h，待其冷却至室温后用丙酮洗涤，过滤，得到中间产物2；
将中间产物2与方酸在氮气保护下与吡啶和丁醇混合，115 ℃下回流反应12 h。反应结束后过滤产物并用乙醚洗涤沉淀。

图2 F-Cl染料的合成路线[13]Fig.2 The synthesis route of compound F-Cl[13]

F-Cl核磁共振(NMR)表征：1H NMR(DMSO,400 MHz)，δ：8.90 (s,2H),8.52 (s,1H),8.02 (s,2H),7.86 (s,2H),7.30 (s,1H),5.90 (s,1H),4.38 (s,2H),2.62 (s,2H),1.99 (s,2H)。

1.3.2 样品处理与光学性质测定将方菁染料F-Cl溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，配制成浓度为500 μmol/L的F-Cl储备溶液，置于冰箱冷藏；
将T30695溶解于超纯水中，配制成浓度为100 μmol/L的DNA母液，置于冰箱冷藏；
将Pb2+标准溶液和Zn2+、K+等金属离子溶解于超纯水中，配制成浓度为500 μmol/L的金属离子储备溶液，置于冰箱冷藏。在测试过程中，向超纯水体系中加入2 μL 500 μmol/L F-Cl储备溶液，振荡混匀后，加入10 μL 100 μmol/L的DNA母液和不同体积的待测金属离子储备溶液，振荡混匀后，室温下避光反应2 h，之后开始检测样品在400～800 nm之间的紫外-可见吸收光谱。

2.1 方酸菁染料F-Cl的聚集调控

为调控溶剂极性对方菁染料F-Cl聚集体的影响，将F-Cl(15 μmol/L)溶解于不同比例的DMSO-超纯水混合液中。如图3(a)所示，在超纯水中，F-Cl展示出两个吸收峰，594 nm处小肩峰(A594nm)为二聚集体吸收峰，648 nm(A648nm)处主峰为单体峰[13]。调控DMSO和水的不同比例，如图3(b)所示，随着体系中DMSO比例的增加，A594nm/A648nm比值逐渐下降，二聚体逐渐消失，单体不断增加，二聚体开始向单体转化，并发生红移现象，说明方菁染料F-Cl的单体会受到DMSO极性的影响。当它们的体积比为2∶8时，A594nm/A648nm几乎不变，此时体系已达到平衡。

为考察其高级聚集体形成能力，研究不同浓度F-Cl的紫外-可见吸收光谱。浓度越高，单体越容易聚集成高级聚集体，由图3(c)可知，随着浓度升高，二聚体和单体都有升高。由图3(d)可知，A594nm/A648nm比值逐渐上升，二聚体的比例越来越高，说明低浓度时，主要以单体形式存在，高浓度时，更容易堆积成二聚体。

图3 F-Cl在不同VDMSO/VH2O中的紫外-可见吸收光谱(a);F-Cl在不同VDMSO/VH2O中的A594nm/A648nm(b);不同浓度F-Cl在超纯水中的紫外-可见吸收光谱(c);不同浓度F-Cl的A594nm/A648nm(d)Fig.3 (a) UV-Vis spectra of F-Cl in different ratios of VDMSO/VH2O;(b) A594nm/A648nm value of F-Cl in different ratios of VDMSO/VH2O;(c) UV-Vis spectra of different concentrations of F-Cl in ultrapure water;(d) A594nm/A648nm value of different concentrations of F-Cl in ultrapure water

2.2 影响因素考察

为了排除T30695单链对聚集体状态的干扰，我们在F-Cl中加入不同浓度的T30695(0、10、20 μmol/L)。如图4(a)所示，3种浓度的A594nm/A648nm比值几乎没有变，这表明T30695单链对聚集体状态没有影响。同样，为了证明Pb2+对F-Cl聚集体状态的影响，选择浓度为0、10、20 μmol/L的Pb2+与F-Cl作用。由图4(b)可知，A594nm/A648nm比值几乎没变，这表明当体系中单独存在Pb2+时，对F-Cl聚集体没有影响。说明体系中单一存在T30695或Pb2+不能诱导F-Cl的二聚集体解聚。

图4 T30695浓度(a)和Pb2+浓度(b)对A594nm/A648nm比值的影响Fig.4 Effect of concentration of T30695(a) and Pb2+(b) on A594nm/A648nm

2.3 体系反应平衡时间

为了优化体系对Pb2+的响应时间，Pb2+(20 μmol/L)和T30695(10 μmol/L)的浓度保持不变，考察不同时间点的F-Cl二聚体和单体转化能力。不加Pb2+为空白对照组，加入Pb2+后，立即测试紫外-可见吸收光谱。由图5(a)可知，加入Pb2+10 min后，紫外-可见吸收光谱无显著改变。由图5(b)可知，加入Pb2+的10 min时，A594nm/A648nm比值降低，逐渐接近平衡，说明此方法10 min即可检测体系中的Pb2+，对Pb2+响应快速。

图5 Pb2+响应时间(a)和反应时间(b)对A594nm/A648nm比值的影响Fig.5 Effect of response time (a) and reaction time(b) of Pb2+ on A594nm/A648nm

2.4 线性范围与检测限

向F-Cl(10 μmol/L)/T30696(10 μmol/L)体系中加入不同体积的Pb2+。由图6(a)可知，随着Pb2+浓度的增加，二聚体峰逐渐下降，单体峰逐渐升高；
由图6(b)可知，A594nm/A648nm比值下降，直至Pb2+浓度为20 μmol/L时达到平衡。这是因为体系中的Pb2+将T30695诱导成G-四链体，将F-Cl的二聚体解聚成单体。由图6(c)可知，在最佳的实验条件下，Pb2+浓度在1～20 μmol/L范围内时呈现良好的线性关系(R2=0.9986)，根据3σ/k，得检测限为0.90 μmol/L。

2.5 特异性

选择9种常见金属离子(Pb2+、K+、Cd2+、Cr3+、Mg2+、Co2+、Ni2+、Zn2+、Ag+，母液浓度为500 μmol/L，工作浓度为20 μmol/L)验证方法的特异性。由图6(d)可知此方法对Pb2+具有很高的特异性。文献报道[19]K+是干扰基于核酸适配体Pb2+检测的金属元素，但结果表明K+的干扰较小，说明此方法可排除K+的干扰。

图6 Pb2+浓度对F-Cl紫外-可见吸收光谱的影响(a);A594nm/A648nm与Pb2+浓度的关系(b);A594nm/A648nm与Pb2+浓度的线性响应(c);F-Cl/T30695体系对Pb2+的特异性响应(d)Fig.6 Effect of Pb2+ concentration on UV-Vis absorption of F-Cl aggregates(a);The relationship between A594nm/A648nm and Pb2+ concentration(b);The linear response between A594nm/A648nm and Pb2+ concentration(c);The specificity of F-Cl/T30695 system for Pb2+ detection(d)

2.6 回收率实验

为了验证该检测手段在自来水中的实用性，进行了加标回收实验。由表2可知，加入的Pb2+浓度与实际测得的浓度差异较小，回收率在94.7%到100.2%的范围内，相对标准偏差(RSD)≤2.21%。该结果表明此方法具有很好的重现性，对自来水中的Pb2+测试具有潜在的应用价值。

表2 水样中Pb2+的测定

开发了一种特异性且快速响应的Pb2+检测方法。该检测方法以Pb2+响应的G-四链体为模板，利用单链和G-四链体对F-Cl二聚体和单体响应能力差异，实现Pb2+检测。该方法操作简单，仅需紫外光谱表征，10 min内快速响应Pb2+，在1～20 μmol/L内具有很好的线性关系，其检测限为0.90 μmol/L。

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