猪冷冻精液的质量评价概述

史文清

（北京市畜牧总站，北京 100107）

猪精子质量直接关系到精子受精能力和配种受胎率。客观地评价精子质量是人工授精和生产的前提条件。从20世纪70年代开始，从猪冷冻精液被证实能够获得健康后代以来，很多冷冻解冻优化方案被提出，人工授精技术措施不断地被优化。最近10年来猪冷冻精液大规模使用，虽然产仔数还不够理想，但是足以证明此技术真正达到了生产使用的要求。精子检测技术的发展迅速，对猪精子冷冻解冻后的质量评价提供了很多可以参考借鉴之处，检测方式从常规评价［1］发展到更多细胞生物学手段，结构上从质膜深入到染色体。文章从精液常规分析、质膜完整性、运动参数、染色质、获能和繁殖产仔情况六个方面阐述猪冷冻精液的质量评价。

在冷冻精液样品分析前，外观检查评价不能忽视。猪的冷冻精液贮存在液氮溶液里也会有安全风险，要确保冷冻精液所处温度不高于-130℃，否则可能造成精子损伤［2］。对于细管冻精，首先要检查细管的颜色，如果发现细管不透明（或者变为白色）就要检查贮存记录、购买与运输各环节。所用细管一般采用可热封的离子型树脂制成，以保证在-196℃低温下维持其抗漏、防菌、防病毒污染及机械抗性［3］。检查外包装无误后，再开展精液的常规分析（SRA），包括精子计数、活力分析与形态分析三方面。

1.1 精子计数

精子计数常用的血细胞计数板也叫改良牛鲍计数板，计数通过计数池中间的精子，可重复使用。为避免污染精液中潜在的传染因子，计数板需要及时消毒、清洗。

还有使用较多的Makler精子计数板，其专用精子计数池也可以反复使用，池深10μm，是一种方便精子计数的设备，用于快速、精确地进行精子计数及活动性和形态学评价，可使用未稀释的样品，无需校正。

Cell-VU CBC（milennium inc，USA）血细胞计数板专门用于细胞手工计数，整个装置是一次性的，省去了清洗环节，降低了检验人员暴露的机会。它有双计数池，载玻片表面支持2个盖玻片，每个盖玻片含一个在背面激光-蚀刻的网格，每个Cell-VU可进行2个测试项目。

1.2 活力检查

精子活力评定的实施，应在可加热至37℃的载物台的显微镜下进行检查，精液标本也应该在同样温度下孵育，载玻片和盖玻片也需要预热。

精子活力指的是前向运动（PR）精子，即a级（精子运动速度＞15μm／s）与b级（精子运动速度10～15μm／s）精子的百分率，精子主动地呈直线或沿大圈运动，不管其速度如何；
非前向运动（NP）精子是指以小圆周泳动，几乎不能移动，或者只尾部摆动；
不活动（IM）精子即是没有运动的精子。精子活率一般指精子（PR＋NP）活动率。

1.3 形态检测

在检查顶体完整率时，通常采用姬姆萨染色方法进行评价，比如使用姬姆萨染色套装（Solarbio），检查方法附在套装说明书上，比较简单。

质膜是精子的基本组成部分，在维持细胞内环境和保持精子活力上起重要作用。在冷冻精液解冻过程中，会对精子染色质结构的完整性造成损伤。异常染色质的结构会导致受精后胚胎发育异常，因此精子染色质结构完整性的检测也是评估精子质量的重要指标之一。质膜完整性检查包括低渗膨胀检验（HOST）与活性染色。

2.1 低渗膨胀检验方法

低渗膨胀试验是一种渗透压检验方式。膜的完整是精卵融合的必要条件，HOST可在一定程度上反映精子的受精能力。在低渗溶液中，精子质膜具有生物活性，水分子向内流入精子胞质内，导致精子尾部的质膜向外周膨胀，尾部发生弯曲肿胀，通过显微镜可以观测到精子质膜对低渗液的膨胀反应；
若精子损伤或者质膜失去生物活性，水分子可以自由通过质膜，胞质内不会积聚水，不会出现明显的肿胀和尾部弯曲［4］。HOST方法简单、迅速，对检验质膜的完整性非常实用。检测时，将猪细管冷冻精液于37℃水浴解冻，在新制备的膨胀液中37℃孵育10 min，在200倍（或400倍）显微镜视野下计算弯尾精子的百分率。通过精子尾部形态判断膨胀精子，如精子尾部有膨胀即为存活精子。详细方法可以参照人类精子检查方法［1］。

2.2 吖啶橙染色方法

吖啶橙（acridine orange，AO）能够与双链DNA结合发出绿色荧光，而与单链DNA结合发出红色或黄色荧光，当精子受到损伤时DNA会变性解链，产生单链DNA。因此，可根据荧光显微镜下绿色荧光强度区分成熟和不成熟精子，计算呈绿色荧光的精子比率，即为精子DNA完整率。

2.3 碘化丙啶染色

碘化丙啶（PI）是死精子特异性荧光染料，当精子质膜完整时染料不能进入精子内部，在荧光显微镜下精子不发荧光；
如精子质膜受损，染料可进入精子内部，在荧光显微镜下发出红光。实验室常用的死精子特异性荧光染料还有Hoechst33258、溴化乙锭（EB）。PI染色操作不当常常会造成假阴性精子，通常的做法是采用二乙酰荧光素（FDA）和PI共同染色，FDA会把活精子标记为绿色。双染色较好地解决了假阳性和假阴性问题，红色荧光标记的为死精子，绿色荧光标记的为活精子。

3.1 运动速度与分级

猪的正常精子长度约为55μm，分头部、颈部、尾部，尾部又分为中段、主段、末段。其中尾部细长，头部呈扁圆型。计算机辅助精子分析（CASA）技术是借助计算机进行精子活力、动（静）态图像等的检测，以获得精子动态、静态各项参数，也称计算机辅助精液分析。原理是借助高速摄像机把显微镜下观察到的精子图像传输到电脑上，通过精子动力学分析软件对精子运动轨迹进行捕捉，计算精子的各种运动速度，对精子活力进行分级；
精子形态学分析软件比照正常精子形态图像，对视野下精子的畸形数、畸形类别及畸形率等指标进行自动识别，分类统计。

3.2 新鲜精液与冷冻精液运动参数的比较

笔者在CASA分析中把猪精子分成四类：A类精子标记为红色，运动速度≥15μm／s；
B类精子标记为绿色，运动速度≥10～＜15μm／s；
C类精子标记为黄色，运动速度5～＜10μm／s；
D类精子标记为白色，运动速度＜5μm／s。猪新鲜精子与冷冻解冻后精子的运动轨迹见图1，在精子活力从72.72%降低到46.03%时候，直线速度（VSL）、曲线速度（VCL）、平均路径速度（VAP）、直线性（LIN）、前向性（STR）、精子头侧摆幅度（ALH）、鞭打频率（BCF）等运动参数均发生显著或极显著变化。

图1 猪新鲜精子与冷冻解冻后精子的运动轨迹（×100）Fig.1 The movement track of fresh and frozen-thawed porcine spermatozoa（×100）

4.1 精子DNA碎片化分析

DNA是精子遗传信息的载体。精子DNA碎片指数（DFI）作为一个精子质量评估的检测指标，与畸形精子指数呈显著正相关，与精子活动率、PR精子百分率及形态正常精子百分率呈显著负相关。有正常生育能力男子的DFI值小于30%［5］。有研究表明，早期自然流产组的精子DFI比例显著高于对照组，说明精子DFI可能与早期自然流产密切相关［6］。

精子染色质结构分析试验（SCSA）和精子染色体扩散试验（SCD）均对精子质量有较高的分析价值［7］。精子染色质完整与否对精子的正常功能至关重要，SCSA在流行病学研究和临床分析中具有重要价值［8］，被认为是检测精子DNA碎片化的金标准。目前主要使用吖啶橙染色方法进行SCSA分析，未受损精子发出绿色荧光，而受损精子发出红色或黄色荧光，通过流式细胞仪可以做出判定。

4.2 彗星试验

彗星试验指单细胞凝胶电泳（SCGE），可直接在荧光显微镜下观察单个细胞DNA损伤，是检测精子DNA损伤程度的有效手段。由于电泳时损伤的DNA从核中溢出，朝阳极方向泳动，产生的尾状带形似“慧星”，“慧星”长度指示的是DNA迁移距离，“慧星”荧光强度代表了迁移DNA的量，从而可以定量检测精子中的DNA损伤程度。

4.3 精子TUNEL分析

TUNEL指用DNA聚合酶和末端脱氧核糖核酸转移酶（TdT）标记DNA链断端的核酸，进行的末端反应又称为ISEL技术。TUNEL分析特异性强、敏感性高，可以检测精子凋亡所致的DNA损伤情况。需要通过激光共聚焦荧光显微镜对采集的图像进行分析。

精子膜的获能状态改变很容易引起顶体反应的提前发生及精子受精能力的丧失。尤其对冷冻解冻后的精子，温度、渗透压和冷冻稀释剂等因素会破坏精子膜和精子结构的稳定性，引起精子的获能状态变化。精子获能是一系列的生理生化反应过程，步骤大致分为激活、获能与顶体反应三个环节。

5.1 仓鼠卵母细胞穿透试验

仓鼠卵母细胞穿透（HOP）试验，也称精子穿透试验。常规穿卵试验是依赖精子的自发性顶体反应而实现的。统计带有尾巴的精子和与精子尾部有解聚的精子总数。

5.2 顶体反应分析

顶体指精子头部的帽状结构，在受精之前应该是完整的，可以穿过卵子透明带与卵质膜融合；
而当精子失去顶体或顶体破损时，精子无法进入卵子，不能进行受精。因此顶体完整性的检测是评价精子冷冻效果的重要指标。

顶体状态的荧光评价方法较简单，更具重复性，并且能得到非常清晰的图像。考马斯亮蓝染色常用来分析精子顶体完整性。利用原位免疫荧光技术，即用异硫氰酸荧光素标记的免疫结合物更能准确地检测精子顶体状态。

5.3 透明带结合检测

由于精子与透明带结合是由受体和配体介导的，透明带结合检测检测精子分子水平上的损伤，是常规精子检测分析技术无法实现的。目前精子结合透明带能力有两种检测方法［9］，一种是透明带结合检测（ZBA），另一种是利用半透明带检测（HZA）。ZBA方法：使用屠宰场的卵巢分离出卵母细胞与精子，进行共同培养，然后使用相差显微镜或者荧光显微镜测定结合到透明带上的精子数量。HZA方法：利用显微操作方法，将卵母细胞切割为两半，去掉细胞质，然后两半透明带分别与对照组和试验组的精液样本孵育，最后使用相差显微镜测定结合的精子数量。新鲜精液和冷冻精液都可以使用HZA方法，缺点是费时和需要复杂技术。当然利用体外受精（IVF）技术来检测精子对卵母细胞的体外受精能力更接近体内的受精过程，能更好地检测出精子的真实质量水平。

猪冷冻精液质量的优劣最终要靠人工授精后母猪的产仔情况和仔猪成活数来检验。猪冷冻精液应用评价中还要注意冷冻剂型、母猪类型、精液处理方法及人工授精方法等因素对繁殖效果产生的影响。

6.1 精液冷冻剂型和母猪类型的影响

1973年S.Salamon等［10］的研究表明，用冷冻颗粒精液人工输精使5头母猪妊娠，分娩后平均产仔数达到7.6头的成绩，同时发现初配母猪的产仔数低于经产母猪。1989年邓强强等［11］的研究表明，用磁盘冻裂成碎片冷冻猪精子，70头经产母猪获得76.5%配种分娩率，平均产仔数达到8.2头，接近鲜精人工授精的效果。随后细管逐渐成为冻精的主流剂型，1991年日本有4 008头母猪使用猪冷冻精液输精，配种分娩率仅达39.6%，产仔数为8.0头［12］。

为了寻找更适合的冷冻精液承载体，2002年B.M.Eriksson等［13］使用了扁平袋（Flat Packs）冻精承载物，205头经产母猪的配种分娩率为72.3%，平均产仔数达11.3头。2009年还有研究报道了塑料袋猪冷冻精液取得不错的效果［14］。

6.2 冷冻精液处理方法的影响

2012年O.Tetsuji等［15］报道，在解冻后精子中添加精浆可以提高母猪妊娠率和产仔数。2015年T.Monika等［16］报道，在冷冻液中添加丁基羟基甲苯可以提高母猪妊娠率和产仔数。

6.3 授精方式的影响

2008年R.Bathgate等［17］在之前的人手术法深部输精技术的基础上，研发了冷冻精液非手术法深部输精，节省了精子用量。猪子宫深部人工授精技术的普及与推广，可以保障较低精子数授精后的效果。2020年邓双义等［18］采用国内某公司的加系长白、大白和杜洛克猪细管冷冻精液（0.5 mL细管约含2亿个有效精子），用子宫内深部输精8亿个有效精子，得到与鲜精相近的情期受胎率和分娩率。

通过以上六方面评价，可以对猪冷冻精液产品有一个全面评估。当然，随着精液检测技术的进一步发展，质量评价将会出现更多方法和更便捷的手段。人们对精子经过冷冻造成的伤害了解得越透彻，冷冻精液生产程序就会越优化、冷冻精液在育种生产中越能够发挥出潜力。