慢性乙型肝炎和乙型肝炎肝硬化患者发生低病毒血症的影响因素及其与肝脏炎症、肝纤维化进展的关系

宣碧碧， 徐永红， 杜忠彩， 刘 玉， 杨玉玲， 边 城

1 青岛大学 医学部，山东 青岛 266021；

2 青岛大学附属医院 a.消化内科， b.感染性疾病科，c.重症医学科， 山东 青岛 266003

慢性HBV感染属于全球公共卫生问题。截至2016年，全球HBsAg平均阳性率约为4.9%，约有3.64亿人感染HBV，每年发生慢性HBV感染相关疾病的患者约有88.7万[1-2]。核苷(酸)类药物(NUC)抗病毒治疗可减轻肝脏炎症，延缓纤维化进程，降低肝细胞癌(HCC)的发生风险[3]。近年研究[4]发现，尽管慢性HBV感染者进行规律抗病毒治疗，但部分患者血清中仍然存在低水平的HBV DNA复制。2018年美国肝病学会提出低病毒血症(low-level viremia, LLV)，即HBV DNA持续或者间歇大于检测下限，但<2000 IU/mL[5]。LLV可能会造成肝脏炎症、纤维化进展，甚至HCC的发生。本研究旨在评估接受NUC抗病毒治疗且HBV DNA<2000 IU/mL的慢性乙型肝炎(CHB)和乙型肝炎肝硬化患者中LLV占比，探究影响LLV发生的因素及其与肝脏炎症、纤维化进展的关系。

1.1 研究对象 选取2020年7月1日—2021年11月30日就诊于青岛大学附属医院肝病门诊口服NUC[恩替卡韦(ETV)、替诺福韦(TDF)或富马酸丙酚替诺福韦(TAF)]抗病毒治疗疗程≥1年，且HBV DNA<2000 IU/mL(检测下限<10 IU/mL)的CHB(HBeAg阳性与HBeAg阴性)和乙型肝炎肝硬化患者，均为NUC初治患者。根据血清中HBV DNA水平(连续测定2次，间隔1个月)分为LLV组(10 IU/ml≤HBV DNA<2000 IU/mL)和完全病毒学应答(CVR)组(HBV DNA<10 IU/mL)。所有研究对象均进行超声评估是否存在肝硬化，CHB诊断符合《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》[2]，肝硬化超声诊断符合《肝病超声诊断指南》[6]。排除标椎：(1)合并HAV、HCV、HDV、HEV、HIV感染；
(2)合并恶性肿瘤；
(3)既往使用干扰素抗病毒治疗；
(4)合并药物性肝炎、酒精性肝炎、非酒精性脂肪性肝病及自身免疫性肝病；
(5)近3个月服用保肝降酶药物；
(6)依从性差及存在HBV P区耐药变异患者。

1.2 观察指标 收集患者一般资料(包括年龄、性别、肝硬化或HCC家族史、抗病毒治疗疗程等)和血清免疫学、生化学、HBV病毒学等指标，计算肝纤维化指数。AST/PLT指数(APRI)=[AST(ULN)/PLT(×109/L)]×100；
纤维化指数(FIB-4)=[年龄(岁)×AST(U/L)]/[PLT(×109/L)×ALT(U/L)1/2]；
GPR=(GGT/ULN)/PLT(×109/L)×100。

1.3 检测方法 清晨抽取空腹血送检血常规、乙型肝炎五项定量、HBV DNA、肝功能、AFP、肝纤维化五项及CD4+绝对计数。乙型肝炎五项定量采用电化学发光法测定，血清HBV DNA定量采用雅培试剂，Real-time PCR(检测值下限<10 IU/mL)方法测定，肝功能采用酶偶联法测定，CD4+绝对计数采用流式细胞术测定。

2.1 LLV构成比 本研究共选取417例研究对象，其中男304例(72.9%)，女113例(27.1%)，平均年龄(43.2±10.5)岁；
124例(29.7%)患者临床诊断为肝硬化，293例(70.3%)患者诊断为CHB；
78例(18.7%)患者有肝硬化或HCC家族史。口服NUC抗病毒治疗1～2年者80例(19.2%)，2～3年者108例(25.9%)，3年及以上者229例(54.9%)。

所有患者均进行高灵敏HBV DNA检测，其中血清未检测出HBV DNA者194例，血清HBV DNA<10 IU/mL者50例，即CVR组共244例，CVR率为58.5%。LLV组(10 IU/mL≤HBV DNA<2000 IU/mL)患者173例(41.5%)，其中10～99 IU/mL者131例(75.7%)，100～999 IU/mL者33例(19.1%)，1000～2000 IU/mL者9例(5.2%)，以10 IU/mL≤HBV DNA<1000 IU/mL为主，占比达94.8%。

2.2 抗病毒治疗前LLV组和CVR组患者临床资料分析

2.2.1 一般资料比较 排除一般资料不完整者123例，共纳入294例研究对象，平均年龄(39.1±10.4)岁，男196例(66.7%)，女98例(33.3%)；
CHB患者187例(63.6%)，肝硬化患者107例(36.4%)；
有肝硬化或HCC家族史者55例(18.7%)。LLV组115例，CVR组179例，其中LLV组肝硬化或HCC家族史的阳性占比及肝硬化患者占比均明显高于CVR组(P值均<0.05)(表1)。

2.2.2 病毒学指标比较 排除病毒学资料不完整者54例，对240例患者抗病毒治疗前HBV DNA及HBV血清标志物进行分析，其中LLV组90例，CVR组150例。结果显示，LLV组抗病毒治疗前HBV DNA>1.0×108IU/mL患者占比及HBeAg阳性率均明显高于CVR组(P值均<0.05)(表2)。由于既往试验方法有限，无确定的HBsAg定量滴度，故未进行研究分析。

2.2.3 生化学、PLT及纤维化指数比较 排除生化学资料不完整者66例，对余下228例患者进行分析，其中LLV组78例，CVR组150例。结果显示，CVR组患者AST、AFP水平以及APRI、FIB-4指数均高于LLV组，PLT水平低于LLV组，差异均有统计学意义(P值均<0.05)(表3)。

2.2.4 抗病毒治疗前LLV发生的影响因素分析 Logistic回归分析结果显示，抗病毒治疗前患者HBeAg阳性(OR=3.009，95%CI：1.346～6.729，P=0.007)、有肝硬化或HCC家族史(OR=2.929，95%CI：1.344～6.383，P=0.007)及HBV DNA水平>1.0×108IU/mL(OR=10.790，95%CI：1.265～92.007，P=0.030)是LLV发生的危险因素，而AST>40 U/L(OR=0.355，95%CI：0.171～0.737，P=0.005)是LLV发生的保护因素。

2.3 抗病毒治疗后LLV组和CVR组患者临床资料分析

2.3.1 一般资料比较 对417例患者抗病毒治疗后一般资料进行分析，结果显示，LLV组患者肝硬化或HCC家族史阳性率明显高于CVR组(P<0.05)；
此外，两组患者抗病毒治疗疗程差异有统计学意义(P<0.001)(表4)。

表1 抗病毒治疗前LLV组和CVR组患者一般资料比较

表2 抗病毒治疗前LLV组和CVR组患者HBV DNA、HBV血清标志物比较

抗病毒治疗疗程不同，患者发生LLV的风险不同。抗病毒治疗1年≤疗程<2年的80例患者中49例(61.3%)发生了LLV，2年≤疗程<3年的108例患者中46例(42.6%)发生LLV，疗程≥3年的229例患者中78例(34.1%)发生LLV。不同抗病毒疗程LLV发生率比较差异有统计学意义(P<0.001)，其中，抗病毒治疗1年≤疗程<2年者与2年≤疗程<3年、疗程≥3年者比较，发生LLV的风险较高(P<0.05)(表4)。

2.3.2 病毒学指标比较 排除160例病毒学资料不完整者，对其余257例患者抗病毒治疗后HBV血清学标志物进行分析，其中LLV组100例，CVR组157例。结果显示，LLV组患者HBsAg、抗-HBc水平及HBeAg阳性率均明显高于CVR组(P值均<0.05)(表5)。

2.3.3 生化学指标比较 排除17例生化学指标资料不完整者，对余下400例患者抗病毒治疗后生化学指标进行分析，其中LLV组166例，CVR组234例。结果显示，LLV组ALT和AFP水平高于CVR组，差异均有统计学意义(P值均<0.001)(表6)。

2.3.4 PLT及肝纤维化指数比较 排除PLT资料不完整者121例，对余下296例患者抗病毒治疗后PLT资料进行统计，并计算APRI、FIB-4及GPR指数，结果显示两组PLT、APRI、FIB-4、GPR差异均无统计学意义(P值均>0.05)(表7)。

2.3.5 肝纤维化五项及CD4+绝对计数 排除肝纤维化五项及CD4+绝对计数资料不完整者274例，对余下143例患者进行分析，结果显示两组肝纤维化五项及CD4+绝对计数差异均无统计学意义(P值均>0.05)(表8)。

表3 抗病毒治疗前LLV组和CVR组患者生化学、PLT及纤维化指数比较

表4 抗病毒治疗后LLV组和CVR组患者一般资料比较

表5 抗病毒治疗后LLV组和CVR组患者HBV血清学标志物比较

2.3.6 抗病毒治疗后LLV发生的影响因素分析 Logistic回归分析结果显示，抗病毒治疗后HBeAg阳性(OR=4.394，95%CI：1.962～9.841，P<0.001)是LLV发生的危险因素；
2年≤抗病毒治疗疗程<3年(OR=0.175，95%CI：0.046～0.674，P=0.010)和抗病毒治疗疗程≥3年(OR=0.170，95%CI：0.048～0.600，P=0.006)是LLV发生的保护因素，即抗病毒治疗疗程越长，患者出现LLV的风险越小。

2.4 LLV与肝脏炎症、纤维化进展相关性分析

2.4.1 LLV与肝脏炎症进展的相关性分析 排除抗病毒前后ALT、AST、AFP资料缺失的患者，对余下289例研究对象抗病毒治疗前后ΔALT、ΔAST及ΔAFP(抗病毒治疗前-抗病毒治疗后差值)进行比较，以其变化程度评价肝脏炎症进展情况。结果显示，两组ΔAST、ΔAFP差异有统计学意义(P值均<0.05)(表9)。进一步分析LLV与肝脏炎症的相关性，发现ΔAST(τ=-0.114，P=0.018)、ΔAFP(τ=-0.192，P<0.001)与LLV呈负相关。

2.4.2 LLV与肝纤维化进展的相关性分析 鉴于抗病毒治疗前LLV组和CVR组患者PLT、APRI及FIB-4比较差异有统计学意义，为进一步研究LLV对这些指标的影响，排除抗病毒前后PLT、ALT、AST、GGT资料缺失的患者，比较了余下149例患者抗病毒治疗前后ΔPLT、ΔAPRI及ΔFIB-4(抗病毒治疗前-抗病毒治疗后差值)，以其变化程度评价肝纤维化进展情况。结果显示，CVR组患者ΔAPRI及ΔFIB-4明显高于LLV组(P值均<0.05)(表10)。进一步分析LLV与肝纤维化的相关性，发现ΔAPRI(τ=-0.210，P=0.002)、ΔFIB-4(τ=-0.202，P=0.003)与LLV呈负相关。

表6 抗病毒治疗后LLV组和CVR组患者生化学指标比较

表7 抗病毒治疗后LLV组和CVR组患者PLT、APRI、FIB-4、GPR指数比较

表8 抗病毒治疗后LLV组和CVR组患者肝纤维化五项及CD4+绝对计数比较

表9 LLV组和CVR组患者抗病毒治疗前后ΔALT、ΔAST及ΔAFP比较

表10 LLV组和CVR组患者抗病毒治疗前后肝纤维化指数比较

目前，CHB治疗的目标是最大限度地长期抑制HBV复制，减轻肝细胞炎症坏死及肝脏纤维组织增生，延缓和减少肝功能衰竭、肝硬化失代偿、HCC和其他并发症的发生，改善患者生活质量，延长生存时间[2]。研究发现，即使接受NUC抗病毒治疗，仍有部分患者的肝纤维化有所进展。Cho等[7]发现HBV DNA<2000 IU/mL的肝硬化患者接受NUC治疗后，发生肝硬化相关疾病的风险降低，生存时间延长。Sun等[8]对比CHB患者抗病毒前后肝脏病理学变化，证实LLV可以导致肝脏炎症、纤维化进展。因此，对LLV进行深入研究具有重要的临床意义。Lee等[9]发现口服ETV抗病毒治疗的894例CHB患者中，LLV发生率为26.8%。Kim等[10]调查的875例ETV治疗的CHB患者中，LLV发生率为43.1%。对于LLV的诊断，要求HBV DNA检测下限值<10 IU/mL。研究[11-12]发现，高灵敏PCR方法对于HBV DNA的检出率明显高于普通PCR检测。世界卫生组织、美国肝病学会、欧洲肝病学会、亚太肝病学会均推荐采用高灵敏的HBV DNA检测方法，即检测下限<10 IU/mL[4, 13-15]。本研究采用高灵敏PCR方法(HBV DNA检测值<10 IU/mL)，以10 IU/mL≤HBV DNA<2000 IU/mL为LLV诊断标准，结果显示LLV构成比为41.5%，其中10 IU/mL≤HBV DNA≤99 IU/mL占比高达75.7%。而现阶段，我国大部分医院的HBV DNA检测下限为≤200～500 IU/mL。因此，若采用HBV DNA≤200～500 IU/mL的普通PCR方法检测，可能导致75.7%的 LLV患者漏诊。故对于CHB和肝硬化患者应该采用高灵敏(检测下限<10 IU/mL)的检测方法监测HBV DNA水平，提高LLV早期诊断率。

研究[16]发现，抗病毒治疗前有肝硬化或HCC家族史是LLV发生明显肝损伤(G≥2和/或S≥2)的主要危险因素。本研究结果亦显示，抗病毒前有肝硬化或HCC家族史可以增加LLV的发生风险。此外，抗病毒治疗前病毒学因素也影响LLV的发生。抗病毒治疗前HBV DNA及HBsAg水平是LLV的重要预测因素[17-18]。本研究中抗病毒前HBV DNA高水平，特别是HBV DNA>1.0×108IU/mL是LLV发生的危险因素。而抗病毒前HBeAg状态对LLV的发生同样至关重要。HBeAg阳性CHB患者在接受ETV或TDF治疗48～52周后，HBV DNA(检测下限<60～80 IU/mL)检出率为33%或24%，而HBeAg阴性为10%或7%[19]；
TAF临床试验结果显示，HBeAg阳性CHB患者接受48周TAF治疗，HBV DNA(检测下限<10 IU/mL)检出率为31%，HBeAg阴性者为9%[20-21]。本研究也证实HBeAg阳性者发生LLV风险高于HBeAg阴性者。而且，本研究发现抗病毒治疗前AST≤40 U/L会增加LLV的发生风险。对于有肝硬化或HCC家族史、HBeAg阳性、HBV DNA>1.0×108IU/mL或AST≤40 U/L的患者，应尽量选择强效抗病毒药物治疗，定期复查高灵敏HBV DNA，以避免发生或及时发现LLV。

长期抗病毒治疗可最大程度抑制病毒复制，一定程度逆转肝损伤[22-23]。韩国90例接受TDF治疗的CHB患者，治疗12、24个月CVR累积发生率分别为75.6%、89.9%[24]。另一项研究[25]显示，92例接受TDF治疗的CHB患者，治疗12、24及36个月CVR累积发生率分别为71%、80%、89%，表明延长抗病毒治疗疗程可以影响CVR发生率，降低LLV发生风险。这与本研究结果相一致，抗病毒治疗疗程超过2年的患者发生LLV的风险明显低于不足2年的患者。提示，适当延长抗病毒疗程可以降低LLV发生风险。然而，即使进行规律抗病毒治疗，仍有部分患者HBeAg未出现血清学转换。相关研究[10]也证实，抗病毒治疗过程中HBeAg状态是影响LLV发生的独立危险因素。本研究中，抗病毒治疗后LLV组HBeAg阳性率高于CVR组，HBeAg阳性仍是LLV发生的危险因素。可见，虽然接受规律抗病毒治疗，但对于HBeAg超过1年持续未阴转的患者，发生LLV的风险较高。因此，抗病毒治疗过程中，应定期检测HBeAg状态。

持续低水平的HBV DNA可能促进肝脏炎症、纤维化进展。研究[16]发现，未进行抗病毒治疗的LLV患者，肝损伤由50%上升至90%。本研究通过比较LLV组和CVR组患者抗病毒治疗前后ΔAST、ΔAFP及ΔAPRI、ΔFIB-4发现，ΔAST、ΔAFP及ΔAPRI、ΔFIB-4与LLV均呈负相关。AST、AFP可以反映肝炎症情况，因此，ΔAST、ΔAFP越大，表明经抗病毒治疗后AST、AFP水平较抗病毒治疗前降低，肝脏炎症程度得到缓解；
APRI、FIB-4是反映肝纤维化程度的指标，ΔAPRI、ΔFIB-4越大，表明经抗病毒治疗后肝纤维化程度较前缓解。由此提示LLV发生的可能性越小，肝脏炎症和肝纤维化进展的程度越慢，但关联强度较弱。而且，血清学指标评价肝脏炎症、纤维化进展的诊断价值较低，肝穿刺活检目前仍是诊断肝脏炎症、纤维化的金标准。

本研究存在以下不足之处：(1)缺乏组织病理学或无创弹性FibroScan检测手段对肝脏炎症及纤维化程度进行分级。采用血清学指标建立的无创模型衡量肝脏炎症、纤维化程度具有一定局限性；
(2)本研究属于回顾性分析，部分患者资料缺失，可能在一定程度上降低了结果的可靠性；
(3)抗病毒治疗时间节点缺乏连续性，且样本量相对较少，研究结论不够全面、完善。因此，LLV与肝脏炎症、纤维化的关系仍需要大样本、前瞻性、多中心的研究，进一步深入探讨与分析。

伦理学声明：本研究方案于2021年3月10日经由青岛大学附属医院伦理委员会审批，批号：QYFY WZLL26423。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突。

作者贡献声明：宣碧碧负责课题设计，资料分析，撰写论文；
杜忠彩、刘玉、杨玉玲参与数据收集，修改论文；
边城、徐永红负责研究设计，指导撰写文章并最后定稿。