微囊化噬菌体治疗细菌感染的研究

张 博，郝 贺，张 楠，吕兴帮，张永英，石玉祥,2*，钟翠红*

(1.河北工程大学生命科学与食品工程学院，邯郸 056000；
2.河北省禽病工程技术研究中心，邯郸 056000)

噬菌体的起源要追溯到100多年前，研究人员通过试验发现噬菌体能够特异性感染细菌，这一发现让噬菌体一度成为治疗细菌病的主流药物，随着噬菌体治疗的应用，人们发现噬菌体的治疗效果并不让人满意，是由于噬菌体的耐酸耐碱及稳定性较差，导致噬菌体易失活，从而达不到治疗细菌感染的效果，因此，噬菌体疗法逐渐淡出了人们的视野[1]。抗生素的出现，成为了人们治疗细菌感染的主要药物，一直持续到现在，但长期使用抗生素，导致细菌的耐药性越来越严重，抗生素的治疗效果显著下降，人们开始寻找代替抗生素的药物[2]。

近几十年来，在格鲁吉亚共和国等国家，噬菌体疗法一直被应用于治疗细菌感染，并且专门建立了噬菌体研发中心，旨在开发噬菌体治疗[3]。作为抗生素治疗的有效补充手段，噬菌体用于临床抗感染治疗在越来越多的国家和地区受到重视，因此亟须系统深入地研究以推动噬菌体临床应用的规范化及安全性。有关生物制剂的微囊化包被技术在国内外已相对成熟，但对噬菌体进行微囊化包被的报道较少。本文就微囊化噬菌体的作用、制备方式及在治疗细菌感染中的应用进行综述，为微囊化噬菌体在畜牧业中的合理应用提供参考。

1.1 噬菌体的分类

噬菌体的结构较为简单，主要由蛋白质衣壳和核酸组成。依据遗传物质可将噬菌体分为双股DNA群(dsDNA)、单股DNA群(ssDNA)、双股RNA(dsRNA)、单股RNA群(ssRNA)。依据形态，双股DNA群下将噬菌体分为肌尾噬菌体(Myoviridae)、短尾噬菌体(Podoviridae)、长尾噬菌体(Siphoviridae)等[4]。依据噬菌体生活周期及繁殖特性，可分为裂解性噬菌体和溶源性噬菌体。在《病毒分类—国际病毒分类委员会第9次报告》中将噬菌体分为6个目，87个科，19个亚科，349个属，2 284个种[5]。

1.2 噬菌体对细菌的感染作用

近年来，抗生素的过分使用，其弊端也逐渐显露出来，能替代抗生素的药物却少之又少，噬菌体是为数不多可以有效代替抗生素的治疗药物，因此人们对噬菌体相关的研究越发深入，微囊化噬菌体治疗有望成为新型治疗细菌感染的药物。Easwa-ran等[6]通过以大肠埃希氏菌为宿主菌，成功分离出与大肠埃希氏菌所对应的裂解性噬菌体，通过试验比较噬菌体处理过的大肠埃希氏菌与未处理的大肠埃希氏菌的生长曲线，证明噬菌体可以有效地抑制大肠埃希氏菌的生长，起到治疗大肠埃希氏菌病的作用。巴西的研究者[7]从奶牛场的牛奶样品中分离出金黄色葡萄球菌并从奶牛场的污水中分离出对应的金黄色葡萄球菌噬菌体，通过试验发现，从污水中分离出的噬菌体可以有效地裂解金黄色葡萄球菌。Kim等[8]将肠炎沙门氏菌噬菌体加入到肉鸡饲料中给鸡食用，发现食用肠炎沙门氏菌噬菌体的肉鸡不但患肠炎沙门氏菌病的概率大幅度降低，还可以促进肉鸡的生长。

随着科学技术的不断发展，高分子技术被用作医学制药，医用纳米材料已经成为目前最具有发展前景的新型材料之一。微囊化技术是一种利用天然或合成高分子材料将固体、液体或气体包封或使其分散于载体基质中而形成微小粒子的过程[9-10]。噬菌体的酸碱耐受性较差，在噬菌体治疗的过程中易失活，达不到治疗的效果，因此需要将噬菌体进行微囊化处理，噬菌体微囊化后可以有效地避免噬菌体治疗过程中的不足。微囊化技术有着诸多的优点，其最显著特点在于能够将噬菌体与外界环境隔离开来，而其化学性质能被完整保留，起到保护噬菌体的作用，并且可以在适当的条件下，又能将其释放出来[11]。微囊化技术的发明，成功地解决了噬菌体杀菌过程中自身易失活的问题，能够起到保护噬菌体的作用。因此，正确地使用微囊化技术可实现对目的药物的控制释放，保护噬菌体免受环境影响，保存噬菌体的活性并有效提高噬菌体的稳定性。

微囊化技术虽然是一种比较新型的技术，但其有着非常广阔的前景，主要是利用一些特殊的方法，使某种特殊的物质达到一定密度，并被另一种或几种物质所包裹，从而形成特殊的状态，满足用药的特殊需求，该技术目前已广泛应用于口服用药的控制释放领域[12]。微囊化噬菌体可以有效地提高噬菌体的耐酸耐碱、在胃液中的稳定性、在胆汁酸盐中的稳定性、在肠液中的稳定性及释放行为、保存状态的稳定性[13]。微囊化技术虽然有着很多的优点，但需要选择出合适的包被材料以及合适的制备方式来进行微囊化包被，才能有效地保证噬菌体的活性，并成功发挥噬菌体的治疗作用。

微囊化噬菌体的制备方法常用液滴法、水油相分离法、干燥喷雾法等对噬菌体进行微囊化包被，在制备微囊化噬菌体的同时还要选择适宜的包被材料进行包被，可以提高噬菌体的包封率及稳定性能。

3.1 液滴法

液滴法主要是通过海藻酸钠溶液与氯化钙溶液间的化学反应，来实现制备微囊化噬菌体，即直接将提前制备好的噬菌体悬浊液和一定浓度的海藻酸钠溶液混合后通过流化床包衣制粒机匀速滴入氯化钙溶液中，进行凝胶化反应形成微球，将形成的微球用去离子水洗涤后置于壳聚糖中覆膜反应形成微囊化噬菌体微球。根据液滴不同的形成方法，液滴法又可进一步分为喷流切割法、气吹液滴法、振动喷嘴法和静电液滴法等方法[14]。液滴法的优点主要在于操作简单，制备过程较为温和，制备出的噬菌体微球形状规则，颗粒饱满成小球状。液滴法的不足之处：①液滴法主要靠海藻酸钠溶液和氯化钙溶液的化学反应来形成，受海藻酸钠溶液浓度的影响，海藻酸钠溶液浓度过高，溶液黏稠，不易形成噬菌体微球，海藻酸钠溶液浓度过低，溶液稀释，也不易形成噬菌体微球。②通过液滴法制备噬菌体微囊化微球的产率相对较低，不易规模化制备噬菌体微球。

3.2 水油相分离法

水油相分离法制备微囊化噬菌体的原理是通过适宜的材料经搅拌过滤后制备成水相，然后将适宜的油类材料搅拌均匀后制备成油相，向混合均匀的油相中缓慢滴入提前制备好的水相，边加边搅拌，随着水相的逐渐增加，混合液由开始的黏度较低逐渐升高，使混合液变黏稠，黏稠的混合液中继续加入水相，混合液由黏稠逐渐稀释，直至水相全部加入并搅拌均匀[15]。水油相分离法的优点是包封率较高，可以有效地保护噬菌体；
局限性是需要噬菌体的包被材料分别能够溶解于水相和油相中。

3.3 干燥喷雾法

干燥喷雾法制备微囊化噬菌体，主要是将提前准备好的噬菌体分散于溶液当中，形成噬菌体悬浊液，通过雾化器使噬菌体悬浊液分散成小液滴，当噬菌体小液滴与热空气接触时，小液滴中的噬菌体迅速蒸发从而形成微粒[16]。干燥喷雾法操作简单，可以大规模生产，但由于操作时温度较高，易降低噬菌体的活性，对噬菌体的破坏较大。

噬菌体早在20世纪就被发现了其在治疗细菌感染方面的作用，d’Herelle等[17]对禽伤寒进行了有关噬菌体的治疗试验，试验结果表明，噬菌体能够取得有效的治疗效果，基本可以确定噬菌体是治疗细菌性疾病的治疗因子。Atterbury等[18]于2007年成功分离出沙门氏菌噬菌体，选用鸡体内的沙门氏菌与其反应，试验结果表明，噬菌体可以成功地消灭鸡体内的沙门氏菌。

马永生等[19]研究表明，对患沙门氏菌病的鸡服用沙门氏菌微囊化噬菌体，可以有效地治疗鸡的沙门氏菌病，当微囊化噬菌体进入机体体内后，其在胃液、胆汁酸盐中保护噬菌体的活性不发生显著的变化，使噬菌体能够以较高的活性进入到肠液中，包被的材料与肠液发生反应，使其中的噬菌体释放出来，杀灭机体内的细菌，达到治疗效果。

综上所述，选用适宜材料微囊化后的噬菌体可以有效地发挥噬菌体的治疗作用，并弥补了噬菌体自身活性易被胃液腐蚀降低的问题，有望成为新型的抗生素替代药物。

5.1 噬菌体治疗的优点

噬菌体在治疗细菌感染时，有着很多抗生素所不具备的优点：①噬菌体具有专一性，能够特异裂解目标病原微生物，而不会破坏其他微生物，抗生素治疗虽然治疗效果很好，但是抗生素在治疗的过程中会破坏其他正常的微生物，导致微生物之间的平衡遭到破坏，有可能会造成感染[20]。②噬菌体在成功抵达细菌感染的部位后，能够自我复制增殖，理论上可以按指数增殖，即一次给药便可达到治疗效果，而抗生素治疗需要多次给药[21]。③噬菌体具有无毒、无残留的特点，人和动物的身体当中都存在着噬菌体，对机体并不会造成危害[22]，当噬菌体清除宿主菌后，会逐渐消亡，而不会存留于机体中。④噬菌体在自然界中广泛存在，所以噬菌体的制备成本较低[23]，筛选噬菌体的周期较短，而抗生素药物的研发周期较长、成本较高。

5.2 微囊化噬菌体治疗的优点

微囊化噬菌体治疗具备噬菌体治疗的全部优点，而且有效地弥补了噬菌体治疗中的不足。噬菌体治疗一般采用口服治疗的方法，当噬菌体进入胃液后，很容易被胃液腐蚀，从而失去活性[24]，微囊化噬菌体能够有效地延长噬菌体在胃液中的存活时间，较好地保存噬菌体的活性[25]。当微囊化后的噬菌体进入肠液后，噬菌体的包被材料与肠液发生反应，使其破裂，从而释放噬菌体，完成与细菌的特异性反应。

5.3 微囊化噬菌体治疗的局限性

微囊化噬菌体的局限性在于：①目前国内外对这方面的研究较少，缺少合适的噬菌体包被材料，其选择的包被材料需要能够形成噬菌体微球，并能够较好地保存噬菌体的活性，提高噬菌体的酸碱耐受性，还要能够在肠液中成功释放。②部分噬菌体携带毒力基因，裂解的噬菌体在与宿主菌反应后，毒力基因不断表达，从而产生毒力因子，对机体产生不利的影响[26]。③选择合适的包被材料并采用合适的剂量是微囊化噬菌体成功的主要因素，包被材料的选择和包被材料浓度的选择，需要大量的试验来辅助证明，这方面还有待进一步研究。

抗生素的过分使用，导致细菌的耐药性愈发严重，治疗效果也在显著下降，寻找一种替代抗生素的药物已经刻不容缓。国内外对噬菌体的研究愈发成熟，其应用也愈发广泛，但有关微囊化噬菌体的研究却较少，这方面的研究仍有待提升。①微囊化噬菌体制备的材料有待探索尝试，寻找适合噬菌体的包被材料。②微囊化噬菌体制备材料的浓度有待探索尝试。③微囊化噬菌体在治疗细菌感染上的应用研究和技术还有待提高。

微囊化噬菌体可以保护噬菌体在胃液中短时间内不被胃液腐蚀，以较高的活性进入到肠液当中，包被材料与肠液发生反应，将噬菌体释放出来，从而达到噬菌体杀灭细菌的作用。微囊化后的噬菌体活性差异性不显著。微囊化噬菌体的合理研发与使用，可以有效地避免噬菌体自身的局限性，使噬菌体的治疗效果得到充分的发挥。微囊化噬菌体期待在一定程度上降低抗生素带来的负面影响，对临床抗菌应用有着非常重要的意义，其在动物疾病治疗方面有着非常广阔的应用前景，具体的微囊化材料还有待进一步研究。