下调miR-27a减轻脓毒症模型大鼠肺损伤

李嘉晋，刘 军，何松于，谌浩云

(绵阳市人民医院 1.急救部；

2.重症医学科， 四川 绵阳 621000)

脓毒症(sepsis)是因感染引起的全身性炎性反应。有文献证实，多数脓毒症患者会出现急性肺损伤(acute lung injury,ALI)，且其发病率最高[1]。miR-27a是在2001年首次被发现的，其在多种炎性状态下表达上调，广泛参与机体抗炎免疫反应，但其脓毒症多导致的急性肺损伤的作用机制目前还尚不明确[2-3]。过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator activated receptor，PPARs)属于配体依赖型核转录因子，PPAR-γ是PPARs家族的一种亚型，且PPAR-γ是近些年研究的热点[4-5]。过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(peroxisome proliferator activated receptor γ，PPAR-γ)可作用于多个靶基因调节细胞的分化、增殖及凋亡等，有抗炎、抗肿瘤等多种生物学作用[6]。本文探究下调miR-27a对脓毒症大鼠肺损伤的影响。

1.1 材料

1.1.1 动物：SPF级雄性SD大鼠40只，体质量(200±20)g[重庆医科大学动物实验中心，动物许可证号：SYXK(渝)2017-0023]。

1.1.2 试剂：转染试剂LipofectamineTM3000(Invitrogen公司)；
miR-27a inhibitor试剂(上海吉玛基因有限公司)；
TNF-α、IL-6的ELISA试剂盒(武汉艾美捷科技有限公司)；
小鼠抗PPAR-γ多克隆抗体(Santa Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物的分组及处理：将大鼠分为4组，假手术组：尾静脉注射10 μL 0.9%氯化钠溶液7 d(sham组)，脓毒症大鼠模型组：尾静脉注射10 μL 0.9%氯化钠溶液7 d，用盲肠结扎穿孔术制备脓毒症大鼠肺损伤模型(sepsis组)：空质粒组：脓毒症大鼠模型尾静脉注射10 μL miR-27a NC质粒7 d(NC组)，质粒组：尾静脉注射10 μL miR-27a inhibitor质粒7 d(miR-27a组)，每组10只。制模前禁食12 h。

1.2.2 标本的采集：消毒大鼠皮肤后开腹，将腹主动脉完全分离，采取并收集5 mL腹主动脉血于离心管中，12 000 r/min离心10 min分离血清，-20 ℃环境中保存待用。消毒皮肤后开腹，取出大鼠肺组织并置于消毒的冻存管中，保存于-80 ℃冰箱中待用。

1.2.3 ELISA检测炎性因子及氧化应激因子含量：ELISA检测各组大鼠血清中TNF-α、IL-6含量，以及丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性。步骤均按照试剂盒说明严格操作。

1.2.4 检测肺水肿程度：取各组大鼠右肺组织，吸干肺组织表面的水分和血液，称湿重(W)，将组织置于70 ℃烘烤箱内烘干72 h至恒重，称取烘干后的重量，即为干重(D)，计算各组大鼠肺组织湿质量/干质量比值(W/D)。

1.2.5 HE染色观察肺组织病理学变化：取各组大鼠肺组织，石蜡包埋，切成10 μm的薄片，脱蜡后酒精复水，苏木精染色并封片，于显微镜下观察。

1.2.6 免疫组化检测肺组织中PPAR-γ表达：将肺组织切片中加入抗原修复液，98 ℃环境中修复15 min，清洗并封闭组织，加入PPAR-γ蛋白一抗，4 ℃环境孵育过夜。加入生物素标记的二抗，37 ℃环境中孵育30 min，于组织在内滴加DAB溶液，苏木素复染后脱水，悬挂晾干后封片，观察组织中PPAR-γ表达。

1.2.7 蛋白质印迹检测肺组织中miR-27a、PPAR-γ蛋白表达：取各组大鼠肺组织并裂解，研磨组织制成均浆，离心，收集上清液并测定总蛋白质含量。取30 μg蛋白质上样煮沸、电泳、PVDF膜转印。封闭组织后加入一抗和二抗，充分混匀后孵育5 min，GABA一抗稀释液加入到组织中，充分混匀后转至PVDF膜上，成像、显色，测定蛋白质吸光度值。

1.3 统计学方法

2.1 各组大鼠血清中炎性因子含量及氧化应激水平比较

和sham组相比，sepsis组大鼠血清中TNF-α、IL-6含量均显著增加(P<0.05)；
miR-27a组血清中TNF-α、IL-6含量较sepsis组显著降低(P<0.05)；
和sham组相比，sepsis组大鼠血清中MDA含量显著升高，SOD活性显著降低(P<0.05)；
miR-27a组血清中MDA含量低于sepsis组，SOD活性明显升高(P<0.05)(表1)。

表1 各组大鼠血清中TNF-α、IL-6含量及MDA、SOD活性比较

2.2 各组大鼠肺组织湿/干(W/D)值比较

Sepsis组肺组织湿/干重比值较sham组增加显著(P<0.05)，miR-27a组大鼠肺组织湿/干重比值较sepsis组减少(P<0.05)(图1)。

*<0.05 compared with the sham group；
△P<0.05 Compared with the sepsis group

2.3 各组大鼠肺组织病理学变化比较

Sepsis组大鼠肺组织结构严重破坏，病变呈弥漫性改变，肺泡膨胀不全、肺泡融合或塌陷，肺泡间隔较厚，肺间质大量炎性细胞浸润或出血；
miR-27a组大鼠肺组织结构得到明显改善(图2)。

图2 各组大鼠肺组织HE染色

2.4 免疫组化比较肺组织中PPAR-γ表达

Sepsis组肺组织内PPAR-γ表达阳性的血管内皮细胞、肺泡上皮细胞和巨噬细胞明显少于sham组(P<0.05)；
miR-27a组大鼠肺组织中PPAR-γ表达阳性的血管内皮细胞、肺泡上皮细胞和巨噬细胞较sepsis组明显增加(P<0.05)(图3)。

图3 各组大鼠肺组织中PPAR-γ表达的免疫组化染色

2.5 蛋白质印迹比较肺组织中miR-27a、PPAR-γ蛋白表达

Sepsis组和NC组大鼠肺组织中miR-27a表达高于sham组，而PPAR-γ蛋白表达低于sham组(P<0.05)；
miR-27a组大鼠肺组织中miR-27a表达较sepsis组明显减少，而PPAR-γ蛋白表达增多(P<0.05)(图4)。

*P<0.05 compared with the sham group；
△P<0.05 compared with the sepsis group

脓毒症可导致机体各个脏器机能衰退，以急性肺损伤最常见。急性肺损伤是一种急性、弥漫性肺部炎性反应，增加肺血管的通透性和肺质量，减少参与正常通气的肺组织。近年来研究显示，miR-27a在多种炎性状态下表达上调，可见miR-27a广泛参与调节机体抗炎免疫反应[7]。有研究发现，miR-27a在脓毒症大鼠中的表达高于正常对照组，进一步在小鼠肺上皮细胞中敲除miR-27a，发现敲除miR-27a的小鼠肺上皮细胞的炎性因子TNF-α、IL-6的表达水平显著下调，减轻了炎性反应[8]。本实验研究发现，敲除miR-27a后脓毒症大鼠肺组织中miR-27a得到抑制，且大鼠降低大鼠肺湿/干重比值，和上述结果一致。

TNF-α、IL-6是瀑布样炎性反应最早期的细胞因子，对病情的严重程度进行有效反应。脓毒症炎性反应发生时，会增加细胞内活性氧(ROS)的产生，攻击生物膜中的多价不饱和脂肪酸发生过氧化反应，导致最终产物MDA的形成，机体会通过MDA来反应ROS攻击损伤的严重程度。本研究结果发现脓毒症模型大鼠出现了强烈的氧化应激反应。有研究证实，miR-27a上调能诱导糖尿病肾病内置网应激和相应的足细胞损伤，其机制为刺激炎性反应、氧化应激及营养缺乏等，敲除miR-27a表达能抑制糖尿病肾病大鼠体内的氧化应激及炎性反应，本研究结果和上述研究结果一致[9-10]。

PPAR-γ是依赖配体激活的转录因子，属于核激素受体超家族，在1990年被首次发现。PPAR-γ有4个亚型，不同组织中PPAR-γ亚型具有不同的生物学作用，参与体内糖稳定、脂肪代谢、细胞分化与凋亡并且具有抗炎和免疫调节作用。研究发现，PPAR-γ主要存在于脂肪组织，表达于多种细胞中，进一步的研究表明，PPAR-γ在肺泡上皮细胞、血管内皮细胞和巨噬细胞中发挥着抗炎作用，具有防治急性肺损伤作用。研究发现，过氧化物酶体增殖物激活受体-γ激动剂能够改善脓毒症导致的内皮损伤，其机制可能与其稳定血管内皮细胞，改善严重炎症反应和凝血功能紊乱有关[11]。本实验研究发现，脓毒症大鼠模型肺组织中PPAR-γ蛋白表达均显著降低，miR-27a干预后大鼠肺组织中PPAR-γ蛋白表达得到明显的提高,和上述研究结果一致。

综上所述，下调miR-27a表达可通过降低炎性反应，改善氧化应激指标，抑制PPAR-γ表达来减轻脓毒症大鼠肺损伤。