五味子发芽特性及特征成分研究

刘永红，李教社，蔡云波，张军义，王 芳

(1.西安职业技术学院生物工程系,陕西 西安 710077；

2.杨凌森禾农业科技有限公司,陕西 杨凌 712100；
3.杨凌新天地设施农业有限公司, 陕西 杨凌 712100 )

南五味子和北五味子分别是木兰科植物华中五味子(Schisandrasphenanthera)和五味子(Schisandrachinensis)的干燥成熟果实[1]。自2000年版《中国药典(一部)》起,国家标准将五味子与南五味子分开,作为两味药收载[2]。南五味子主要产于我国长江流域及西南地区，陕西秦岭地带广泛分布。北五味子主要产于东北。南五味子大多野生，秦岭山区每年8月份由绿转红时基本被抢购采收，野生资源供不应求[3]。筛选优质南五味子品种，开展规范化栽培研究，可以弥补南五味子的市场需求。

1.1 试验地点

西北农林科技大学新天地设施农业有限公司育苗大棚。

1.2 材料

样品1(南五味子)于2017年7月28日采自陕西省西安市长安区五台街办石砭峪小马勺村；
样品2(南五味子)于2017年8月13日采自陕西省西安市长安区五台街办石砭峪小马勺村；
样品3(南五味子)于2017年8月30日采自陕西省西安市长安区五台街办石砭峪小马勺村。样品4(北五味子)于2017年9月2日采自陕西省柞水县丰北河镇土桥村。

1.3 方法

1.3.1 种子前处理方法 将样品3(南五味子)与样品4(北五味子)果实用清水浸泡72 h后搓去果肉，洗净种子，再于水中将秕粒漂出去。取沉于水中下部的饱满种子为供试种子。

1.3.2 发芽处理 第一次发芽试验：清水浸泡南、北五味子1 400粒，分别用不同药剂不同条件(GA350200 mg/kg、6-BA 50200 mg/kg、KT 50200 mg/kg、低温)浸泡5 d、7 d，置于4℃冰箱放置2周，然后放入25℃恒温箱催芽。

第二次发芽试验：清水浸泡南、北五味子5 d后进行脱皮处理，一周后开始进行药剂处理(GA350200 mg/kg、6-BA 50200 mg/kg、KT 50200 mg/kg、ABA 50200 mg/kg、清水)，分别用不同药剂不同的浓度浸泡5 d，直播穴盘，南、北五味子共18处理，每处理25孔125粒，共播9个穴盘，然后放入25℃催芽室进行催芽。

1.3.3 显微结构观察 取五味子样品，分别研磨成粉，过20目筛，取少量细粉于载玻片上，滴2～3滴水合氯醛至粉末上,然后盖上载玻片(盖的时候注意少产生气泡,粉末应全部分散在水合氯醛中)，至酒精灯上加热,至水合氯醛沸腾,反复2～3次，至显微镜下观察。

1.3.4 成分测定

1.3.4.1 供试品溶液的制备。

分别称取不同样品各10.000 g，于40℃烘干至恒重，粉碎，过 40目筛。精密称定各样品粉末0.500 g，置50 mL量瓶中，用无水甲醇提取，超声处理20 min，取出，用无水甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，即得。

1.3.4.2 色谱条件。

温度为室温；
五味子甲素、五味子乙素的流动相为无水甲醇-水(75∶25，V/V);五味子甲素和五味子乙素检测的波长为 224 nm。

1.3.4.3 总糖、总酸、粗蛋白、粗脂肪的测定。采用费林氏试剂法测定总糖的含量，酸碱滴定法测定总酸的含量；
粗蛋白测定(凯氏定氮法，GB5009.5-2003标准)；
粗脂肪测定(索氏抽提法，GB5009.6-2003标准)。

2.1 发芽处理

第一次发芽试验时间为2017年11月20日开始。2017年11月20日清水浸泡南、北五味子1 400粒，11月25-27日分别用不同药剂不同的浓度浸泡5 d、7 d，置于4℃冰箱放置2周，然后放入25度恒温箱催芽。到 2018年1月2日有北五味子GA3200 mg/kg 5 d处理和7 d处理的约有3个发芽，KT 200 mg/kg 5 d处理有1个发芽，KT 200 mg/kg 7d处理1个发芽。2018年1月22日GA3200 mg/kg 5 d处理有3个芽长1～1.5 cm; GA3200 mg/kg 7 d处理有发芽后表现较差，胚芽没有伸长；
6-BA 50 mg/kg 5 d处理有一个发芽。全部撒播入50孔穴盘，放入温室常温条件下出苗，温度10～25℃。3月16日北五味子GA3200 mg/kg 7 d处理出苗2株，4月6日基本出苗整齐。

表1 4月15日北五味子分苗统计数据

第二次五味子发芽实验时间为2018年9月7日开始。2018年9月7日清水浸泡南、北五味子5 d后进行脱皮处理，9月14日开始进行药剂处理(GA350200 mg/kg、6B A50200 mg/kg、KT50200 mg/kg、脱落酸50200 mg/kg、清水)，分别用不同药剂不同的浓度浸泡5 d，9月19日然后直播穴盘，南、北五味子共18处理，每处理25孔125粒，共播9个穴盘，然后放入25度催芽室进行催芽。

2019年1月发现没有出苗迹象，然后做了低温处理1月2日将穴盘全部移出催芽室，放入温室常温条件，当时温度大概4度左右。直到2月2日再放入催芽室，3月11日发现有2个北五味子出苗是ABA两个处理，移出催芽室。4月20日统计：北五味子GA3 200 mg/kg有2个出苗，KT 50 mg/kg有1个出苗，ABA 50 mg/kg有5株出苗，清水处理有2株出苗。5月5日统计：北五味子：GA350 mg/kg有4个出苗，GA3200 mg/kg有8个出苗，KT 50 mg/kg有1个出苗，KT200 mg/kg有2个出苗。ABA 50 mg/kg有15株出苗，ABA 200 mg/kg有2株出苗；
6-BA 50 mg/kg有2 株出苗，清水处理有6株出苗。5月10日统计：北五味子GA350 mg/kg有8个出苗，GA3200 mg/kg有14个出苗。KT 50 mg/kg有1个出苗，KT 200 mg/kg有3个出苗。ABA 50 mg/kg有21株出苗，ABA 200 mg/kg有2株出苗；
6-BA 50 mg/kg有3株出苗，6-BA 200 mg/kg有1株出苗，清水处理有11株出苗。

南五味子：6-BA 200 mg/kg有1 株出苗。

表2 6月3日北五味子分苗统计数据

从两年的实验数据可以看出，北五味子在不同药剂间，同一药剂不同浓度间，同一药剂不同天数间的处理后发芽数量对比不是很明显，甚至在清水处理和药剂处理间也没用差异，说明这两次的五味子发芽都是常规时间的正常出苗，和药剂没有什么关系。

2.2 显微结构观察

1号五味子，种皮外层石细胞壁厚，纹孔细密，呈多角形。种皮内层石细胞壁厚，纹孔较大，有脂肪粒。果皮分泌细胞及角质层纹由多个维管束围成，有角质纹线。螺纹导管无壁。2号五味子，种皮外层石细胞壁较厚，呈长多角形，纹孔较大，含棕色物。种皮内层石细胞壁较厚，呈类圆形，纹孔较大。淀粉粒圆形，内含棕色物。果皮表皮分泌细胞呈多角形，有角质纹线。3号五味子，种皮外层石细胞壁薄，纹孔较大，呈多角形。种皮内层石细胞呈类圆形，壁稍厚，纹孔大。胚乳细胞含脂肪油，壁稍厚。淀粉粒较多，呈圆形。螺纹导管壁薄，细密。4号五味子，种皮外层石细胞壁较薄，纹孔小，类圆形。种皮内层石细胞壁薄，纹孔小，呈多角形。胚乳细胞壁薄，含脂肪油。淀粉粒较多，圆形。

研究结果显示南五味子样品由绿变红的成熟过程中，种皮石细胞壁由厚变薄，纹孔由细密变大，淀粉粒增多。胚乳细胞内出现脂肪油。

图1 南、北五味子显微结构图(1 1号样品，a石细胞，b棕色物；
2 2号样品，a石细胞，b分泌细胞；
3 3号样品，a 石细胞，b脂肪油；

2.3 成分测定

五味子含有挥发油、有机酸、维生素、木质素、三萜、多糖等化学成分。五味子具有明显的抗肝脏损伤、抗氧化的作用，五味子所含木脂素因具有降低肝脏细胞SGPT作用而备受重视。《中国药典》中，五味子是以其所含的五味子醇甲作为药材的质量控制指标，而五味子甲素、五味子酯甲亦是其重要的木脂素类成分之一。

表3 不同南、北五味子样品成分比较

张丽萍报道，赤霉赤和低温处理有打破种子休眠的作用，但裂口率还是很低，且不整齐，表现出较强的野生特性[4]。高玉刚报道，常规层积20 d后浸泡赤霉素能够显著的促进五味子种子萌发，但是种子清洗后直接进行GA3参与处理无显著效果[5]。研究报道GA3、6-BA、KT和脱落酸有促进植物胚状体或愈伤组织分化、抽芽的效果[6、7]，我们两年的试验数据表明，北五味子用GA3、6-BA、KT和脱落酸不同浓度间、不同天数间的处理后发芽数量对比不是很明显，甚至在清水处理和生长调节剂处理间也没用差异，说明这两次的五味子发芽都是低温处理后的正常出苗，和生长调节剂关系不大。这和张彩丽报道的沙藏前用GA3和CuSO4处理五味子种子极显著提高了发芽率不同[8]，可能和五味子品种不同及具体试验条件有关。第一年试验中，南五味子没有发芽，分析可能和南五味子种子提前采收没有达到生理后熟有关。第二年专门挑选了成熟的南五味子果实，结果只有6-BA 200 mg/kg处理有1 株出苗，说明南五味子的催芽试验研究有待继续深入研究。

显微鉴定表明，南五味子样品在7到8月份的成熟过程中，种皮石细胞壁由厚变薄，纹孔由细密变大，淀粉粒增多，胚乳细胞内出现脂肪油，这和其外在的性状特征有一定的对应性。南、北五味子也可以通过其显微结构的不同鉴别出来。总糖、总酸、粗蛋白及粗脂肪检测结果表明，南五味子成熟过程中，糖分增加，酸度性成分变化不大，粗蛋白和粗脂肪降低。南五味子所含五味子甲素和五味子酯甲在7-8月份成熟过程中含量变化不大。北五味子和南五味子比较，总糖、粗蛋白、粗脂肪含量变化不大，北五味子总酸含量245.52 g/kg显著高于南五味子总酸含量23.98 g/kg。但南五味子五味子甲素和五味子酯甲含量(3.66 mg/g、2.04 mg/g)高于北五味子(0.60 mg/g、0.20 mg/g)。五味子的五味子醇甲、酯甲、甲素是五味子中木酯素的主要成分，也是评价五味子质量标准的依据[9，10]， 这表明秦岭地带南五味子品种相比东北引进的北五味子有一定优势，开展南五味子规范化栽培有一定现实意义。另外，程敏报道，北五味子及北五味子南移栽培品种含有五味子醇甲、五味子甲素，但都不含五味子酯甲[11]，但我们的试验结果表明北五味子南移栽培品种含有五味子酯甲。