MerTK表达和ERK激活对心肌梗死后产生骨桥蛋白修复性巨噬细胞功能成熟至关重要

　MerTK 表达和 ERK 激活对心肌梗死后产生骨桥蛋白的修复性巨噬细胞的功能成熟至关重要 导读

　背景：

　骨桥蛋白在心肌梗死（ MI ）组织修复过程中对于加速修复性纤维化以及清除死细胞发挥重要作用，并且半乳糖凝集素-3hi CD206 + 巨噬细胞是 MI 后骨桥蛋白的主要来源。白细胞介素-10 - STAT3–半乳糖凝集素 3 轴线对 MI 后心肌巨噬细胞 Spp1(编码骨桥蛋白)的转录激活至关重要。这里研究者探究了产生骨桥蛋白的巨噬细胞功能成熟更详细的机制。

　方法和结果：在 MI 后的心脏中，Spp1 的转录活化几乎特异的发生在 MerTK+ 半乳糖凝集素-3 hi 巨噬细胞中。K MerTK 在半乳糖凝集素- -3 3 hi hi 巨噬细胞中的产生对于功能成熟至关重要，包括胞葬作用和 1 Spp1 转录活性。

　MerTK+ 半乳糖凝集素- -3 3hi hi 巨噬细胞能够显著活化 3 STAT3 和 和 ERK。抑制 STAT3 能够抑制产生骨桥蛋白的 MerTK+ 半乳糖凝集素-3 hi 巨噬细胞的分化，然而，STAT3 的活化并不足以诱导 Spp1 的转录活性。抑制 ERK 能够在不影响 MerTK 或者半乳糖凝集素-3 表达的情况下抑制 Spp1 的转录活性。同时活化 ERK 是 Spp1 转录活化所必需的。在 Il-10 敲除增强的绿色荧光蛋白—Spp1 敲入的小鼠 MI 后，产生骨桥蛋白的巨噬细胞减少但是并不完全消失。白细胞介素-10 和巨噬细胞克隆刺激因子协同激活STAT3 和 ERK，并且促进骨髓衍生巨噬细胞中产生骨桥蛋白 MerTK+ 半乳糖凝集素-3 hi 巨噬细胞的分化。在 MI 的心脏中同时利用抗白介素-10 以及抗巨噬细胞克隆刺激因子的抗体能够大幅度降低产生骨桥蛋白的巨噬细胞的数量。

　结论：

　白介素- -0 10 和巨噬细胞克隆刺激因子能够协同活化心肌巨噬细胞中的3 STAT3 和 和 ERK ，反之上调半乳糖凝集素- -3 3 和 和 MerTK ，导致产生骨桥蛋白巨噬细胞的功能成熟。

　实验设计

　结果

　1 1

　I MI 后 后 K MerTK 在心肌骨桥蛋白产生的巨噬细胞中表达

　研究者分析了 EGFP-Spp1 敲入的报告小鼠在假手术或者 MI 后三天的心脏。尽管在两者的心脏中都发现了巨噬细胞，但是每个组中的细胞具有不同的特性。典型的是，产生骨桥蛋白半乳糖凝集素-3hi 的巨噬细胞在 MI 后的心脏中出现。在假手术组的心脏中，心肌F4/80+

　CD11b+ Ly6G − 巨噬细胞表达 MerTK（图 1A）。这一结果与其他的报道一致，并且说明 MerTK+ +巨噬细胞在维持组织内稳态中发挥重要作用。在 MI 后的心脏中 MerTK+ 巨噬细胞的绝对数量增加（图 1A-1C）。MerTK 在半乳糖凝集素-3hi 巨噬细胞中表达（图 1D）。绿色荧光蛋白表达的巨噬细胞共表达 MerTK 和半乳糖凝集素-3（图 1E）。因此，共表达 MerTK 和半乳糖凝集素-3 的心肌巨噬细胞能够在 MI 后产生骨桥蛋白。

　 图 1. 半乳糖凝集素-3hi

　MerTK+巨噬细胞是 MI 后骨桥蛋白的重要来源。（A-C）流式细胞分析假手术和 MI 后三天 F4/80+

　CD11b + Ly6G − 巨噬细胞的表达；图 A 散点图说明 F4/80 +

　CD11b+ Ly6G − 巨噬细胞内半乳糖凝集素-3 和MerTK 表达；B 图条形图说明 F4/80+

　CD11b + Ly6G − 细胞中半乳糖凝集素-3 hi

　MerTK + 细胞的比例；C 图条形图说明每 mg 半乳糖凝集素-3 hi

　MerTK+

　 F4/80 +

　CD11b+ Ly6G − 的细胞数量；（D-E）流式分析 MI 后半乳糖凝集素-3 hi

　MerTK + 和半乳糖凝集素-3 hi

　MerTK - 表达 F4/80 +

　CD11b + Ly6G − 细胞中 EGFP-Spp1 的表达。图 D 散点图表示 MI 后三天 F4/80+

　CD11b + Ly6G − 细胞中半乳糖凝集素-3 和 MerTK 表达；图 E 直方图代表 MI 后三天半乳糖凝集素-3 hi

　MerTK + 和半乳糖凝集素-3 hi

　MerTK - 表达 F4/80 +

　CD11b + Ly6G − 细胞中 Spp1-GFP 表达的细胞；流式细胞分析至少进行了 3 次独立实验，数据是均值±SEM，***P<0.001，EGFP 表示增强型绿色荧光蛋白，GFP 表示绿色荧光蛋白，MerTK 是 Mer 酪氨酸激酶，MI 表示心肌梗死。

　K 2 MerTK 的表达是产生骨桥蛋白巨噬细胞功能成熟所必需的

　巨噬细胞中，CD206+ (M2)亚型被划分为修复型巨噬细胞。白介素-10 和白介素-4 诱导 M2样巨噬细胞的分化以及半乳糖凝集素-3 的表达，但是只有白介素-10 能够诱导 Spp1 的转录活化。在 BM 源性的 CD11b+ Ly6G − 细胞的培养中，rIL-10 能够诱导 MerTK 和半乳糖凝集素-3 的表达，而 rIL-4 只能诱导半乳糖凝集素-3 的表达（图 2A 和 2B）。当用 rIL-10 刺激 EGFP-Spp1-敲入

　报告小鼠的 BM 源性 CD11b+ Ly6G − 细胞时，研究者发现在 MerTK 阳性的细胞中 Spp1 转录活化（图2C）。然而研究者并未在 MerTK 阴性的细胞中观察到 Spp1 的转录活化（图 2D）。因此 MeTK的表达是产生骨桥蛋白巨噬细胞功能成熟所必需的。

　 图 2. 体外白介素-10 处理后骨髓源性 CD11b+ Ly6G − 细胞分化为产生骨桥蛋白的细胞，能够同时表达半乳糖凝集素-3hi 以及 MerTK。（A-D）CD11b + Ly6G − 细胞取自 8-到 10-周 EGFP-Spp1 敲入报告小鼠的骨髓，并且利用 rIL-4或者 rIL-10 共培养 3 天。A 和 B 图采用流式分析检测了细胞内半乳糖凝集素-3 和 MerTK 表达（每组中 n=5）；图 A 散点图说明 rIL-4 或者 rIL-10 处理的 CD11b+ Ly6G − 细胞内半乳糖凝集素-3 和 MerTK 表达；图 B 条形图说明CD11b+ Ly6G − 细胞中半乳糖凝集素-3 hi MerTK + 细胞的表达；图 C 散点图说明 rIL-10 处理 MerTK + CD11b + Ly6G − 细胞中 Spp1-GFP 的表达；图 D 直方图表示半乳糖凝集素-3hi MerTK + 和半乳糖凝集素-3 hi MerTK − 表达的 CD11b + Ly6G − 细胞中 Spp1-GFP 的表达；流式细胞分析至少进行了 3 次独立实验，数据是均值±SEM，***P<0. 01，EGFP 表示增强型绿色荧光蛋白，GFP 表示绿色荧光蛋白，MerTK 是 Mer 酪氨酸激酶，MI 表示心肌梗死，rIL 表示重组白介素。

　3 3 STAT3 信号通路诱导 MerTK

　研究者在之前的报道中证实 1 Spp1 的转录活化需要 3 STAT3 信号通路的活化。

　为了证实 STAT3的活化参与 K MerTK 的表达，研究者在 Stattic（STAT3 抑制剂）存在或不存在的条件下，利用rIL-10 刺激 EGFP-Spp1 敲入报告小鼠的 BM 源性 CD11b+ Ly6G − 细胞。在 Stattic 存在时，没有BM 源性的 CD11b+ Ly6G − 细胞分化为 MerTK + 半乳糖凝集素-3 hi 的亚型（图 3A 和 3B）。在 rIL-10 刺激后，Lgals3 敲除小鼠中的 CD11b+ Ly6G − 细胞分化为 MerTK 表达细胞的速率与 WT 小鼠相同（图3C）。

　接下来，在 EGFP-Spp1 敲入报告小鼠中 rIL-10 刺激用 BM 源性 CD11b+ Ly6G − 细胞中，将 MerTK通过小干扰 RNA 显著敲低（图 3D）。MerTK 小干扰 RNA 敲除后并不影响 STAT3 的活化（图 3E），

　但是却降低了半乳糖凝集素 3hi CD206 + 巨噬细胞的分化能力（图 3F 和 3G），并且显著抑制 CD206 +巨噬细胞中 Spp1 的转录活性（图 3H 和 3I）。研究者在 Spp1 WT 和敲除小鼠的 BM 源性 CD11b+ Ly6G− 细胞中观察到在 rIL-10 刺激后 MerTK+半乳糖凝集素 3hi 亚群的分化能力相似（图 3J）。

　K MerTK 能够特异性的调节炎症环境中凋亡细胞的吞噬作用，并且这一生物学过程需要K MerTK 的活化。然而将过氧化物处理的凋亡心肌细胞与 CD11b+ Ly6G − 细胞共培养，并未诱导 Spp1的转录活性。此外，MerTK 的配体 Gas6 是一种维生素 K 依赖的蛋白，在 MerTK 活化的下游信号通路中发挥重要作用。Spp1-EGFP 敲入的小鼠 MI 后利用维生素 K 抑制剂 warfarin 处理，在0-3 天能够抑制 Gas6 的功能。然而两组 Spp1 的转录活性相似。因此，K MerTK 通过 3 STAT3 信号通路活化上调，并且 K MerTK 的表达能够活化半乳糖凝集素- -3 3

　i hi 巨噬细胞的分化以及 1 Spp1 的转录。

　 图 3. STAT3-MerTK-Galectin-3 轴线调节体外骨桥蛋白的表达。（A-B）CD11b+ Ly6G − 细胞取自 8-到 10-周 WT小鼠的骨髓并且利用 rIL-10+DMSO 或者 rIL-10+Stattic 培养 3 天，图 A 散点图表示 CD11b+ Ly6G − 细胞中半乳糖凝集素-3 hi MerTK + 的表达；图 B 条形图表示 CD11b + Ly6G − 细胞半乳糖凝集素-3 hi MerTK + 的表达（每组 n=5）；（C）CD11b+ Ly6G − 细胞取自 8-到 10-周 WT 或者 Lgals3 KO 小鼠的骨髓并且利用 rIL-10 培养 3 天，条形图说明经过流式分析 CD11b+ Ly6G − 细胞 MerTK 的表达（每组 n=5）；（D-I）CD11b + Ly6G − 细胞取自 8-到 10-周 EGFP-Spp1 敲入报告小鼠的骨髓，并且在 rIL-10 培养 3 天的同时进行 siControl 或者 siMerTK，条形图说明 CD11b+ Ly6G − 细胞中 MerTK（图 D）和 pSTAT3（图 E）的表达；F 图散点图代 CD206+

　CD11b +

　Ly6G − 细胞中半乳糖凝集素-3；G 图条形图说明 CD11b+ Ly6G − 细胞中半乳糖凝集素-3

　hi CD206 + 的表达；H 图散点图表示 CD206 +

　CD11b + Ly6G − 细胞中的Spp1-GFP；I 图条形图说明 CD11b+ Ly6G − 细胞中 Spp1-GFP 的表达（每组 n=5）；CD11b + Ly6G − 细胞取自 8-到 10-周 WT 或者 Spp1 敲除小鼠，并且利用 rIL-10 培养 3 天，图 J 条形图说明 CD11b+Ly6G−细胞中半乳糖凝集素

　-3hi MerTK + 的表达（每组 n=3）。流式细胞分析至少进行了 3 次独立实验，数据是均值±SEM，***P<0. 01，n.s.表示没有显著性差异，EGFP 表示增强型绿色荧光蛋白，GFP 表示绿色荧光蛋白，MerTK 是 Mer 酪氨酸激酶，MI表示心肌梗死，rIL 表示重组白介素，STAT3 表示信号转导和转录激活因子 3，WT 表示野生型。

　4 4

　 I MI 后心肌巨噬细胞中 K MerTK 的表达需要 3 STAT3 的活化

　研究者之前报道称相较于 WT 小鼠，在 Il-10 敲除的 MI 心脏心肌巨噬细胞中 STAT3 酪氨酸磷酸化的水平更低且半乳糖凝集素–3hi CD206 + 亚群更少。在本研究中， 研究者发现在 Il- - 10 KO小鼠中 MerTK+ + 半乳糖凝集素- -3 3hi hi 巨噬细胞的比例和绝对数量显著少于 T WT 小鼠（图 4A-4C）。

　研究者之前报道 Stattic 处理能够抑制 MI 后产生骨桥蛋白半乳糖凝集素-3hi CD206 + 巨噬细胞的出现。在这里 c Stattic 抑制 I MI 三天后心肌巨噬细胞中 3 STAT3 的磷酸化，并且显著降低 MI后心脏中 MerTK+ 半乳糖凝集素- -i 3hi 巨噬细胞的比例和绝对数量（图 4D-4F）。相反，MI 后心脏中 MerTK+ 巨噬细胞的比例和绝对数量在 Lgals3 敲除的小鼠和 WT 小鼠中相似（图 4G-4H）。在 Spp1 敲除的小鼠和 WT 小鼠中 MerTK+半乳糖凝集素-3hi 巨噬细胞的比例相似（图 4I-4J）。因此，MI 后依赖心肌巨噬细胞中 STAT3 活化诱导 MerTK 的表达不依赖于半乳糖凝集素-3 或者骨桥蛋白的表达。

　 图 4. 抑制 STAT3 酪氨酸的磷酸化能够抑制 MI 后心肌细胞中 MerTK 的表达。（A-C）流式分析检测 WT 和 Il-10敲除小鼠 MI 三天后，F4/80+ CD11b + Ly6G − 细胞中半乳糖凝集素-3 以及 MerTK 的表达；图 A 散点图表示F4/80+ CD11b + Ly6G − 细胞中半乳糖凝集素-3

　hi MerTK + 的表达；图 B 和图 C 条形图分别说明 F4/80 + CD11b + Ly6G − 细胞中半乳糖凝集素-3 hi MerTK + 细胞的比例和细胞数量（每组 n=5）；（D-F）从 MI 前 1 天到 MI 后 3 天对 WT 小鼠腹腔注射 DMSO 或者 Stattic，图 D 说明 F4/80+ CD11b + Ly6G − 细胞中半乳糖凝集素-3 hi MerTK + 细胞的散点图，图 E条形图说明 CD11b+ Ly6G − 细胞中半乳糖凝集素-3 hi MerTK + 细胞的比例，图 F 说明每毫克半乳糖凝集素

　-3 hi MerTK + F4/80 + CD11b + Ly6G − 细胞的细胞数量（每组 n=8）；（G-H）流式分析 WT 或者 Lgals3 敲除小鼠 MI 后，F4/80+ CD11b + Ly6G − 细胞中 MerTK 的水平，图 G 条形图说明 F4/80 + CD11b + Ly6G − 细胞中 MerTK+细胞的比例以及每毫克细胞数量（n=4）；（I-J）流式分析 WT 或者 Spp1 敲除小鼠 F4/80+ CD11b + Ly6G − 细胞中半乳糖凝集素-3 hi MerTK +的表达；图 I 散点图代表 F4/80+ CD11b + Ly6G − 细胞中乳糖凝集素-3 hi MerTK + 的表达；图 J 条形图说明F4/80+ CD11b + Ly6G − 细胞中 MerTK+细胞的比例。流式细胞分析至少进行了 3 次独立实验，数据是均值±SEM，*P<0.05, ***P<0.001，n.s.表示没有显著性差异，EGFP 表示增强型绿色荧光蛋白，GFP 表示绿色荧光蛋白，MerTK 是 Mer 酪氨酸激酶，MI 表示心肌梗死，pSTAT3 表示磷酸化的信号转导和转录激活因子 3，WT 表示野生型，rIL 表示重组白介素。

　5 巨噬细胞克隆刺激因子 (M- - CSF) 参与 I MI 后产生 N OPN 巨噬细胞的分化

　当 Il-10 敲除 EGFP-Spp1 敲入的报告小鼠产生 MI 时，在心肌巨噬细胞中绿色荧光蛋白——阳性细胞的比例显著降低，但是并没有完全消失（图 5A 和 5B），表明 除了白介素- -0 10 存在其他细胞因子能够促进产生骨桥蛋白的巨噬细胞分化。已知 M M- -F CSF 在活化巨噬细胞的分化中发挥重要作用，并且白介素- -0 10 和 和 M M- -F CSF 的共刺激调节 K MerTK 的表达。

　 为了探究 M-CSF 在 MI 后产生骨桥蛋白巨噬细胞分化中的作用，研究者 利用对照 IgG、 、 anti- -白介素- -0 10 的抗体、 anti- - 白介素 0 10 的抗体以及 anti- -F MCSF 的抗体处理 EGFP- -1 Spp1 敲入的 MI小鼠。在心肌巨噬细胞中 STAT3 磷酸化（图 5C）、MerTK+ 半乳糖凝集素-3 hi 细胞的绝对数量（图5D-5F）以及绿色荧光蛋白—阳性细胞的比例和绝对数量受抗-白介素-10 抗体的抑制，在联合应用抗-白介素 10 以及抗 MCSF 抗体时大幅度抑制。

　 研究者在体外将 EGFP-Spp1 敲入小鼠 BM 源性 CD11b+ Ly6G − 细胞利用 rIL-10 或者 rIL-10 与rMCSF 联合刺激。结果发现 rIL- -0 10 和 和 rM- -F CSF 的联合刺激能够诱导更多 MerTK+ + 半乳糖凝集素- -3 3hi hi细胞以及绿色荧光蛋白 — 阳性细胞的活化。同样， rIL- -0 10 与 与 rM- -F CSF 联合刺激能够显著活化胞葬作用。因此 白介素- -0 10 和 和 M M- -F CSF 能够协同促进产生骨桥蛋白 MerTK+ + 半乳糖凝集素- -3 3hi hi 巨噬细胞的分化，导致 I MI 心脏中死亡细胞的有效清除。

　 图 5. 白介素-10 需要 M-CSF 诱导体内产生骨桥蛋白巨噬细胞的分化并且上调半乳糖凝集素-3 以及 MerTK。（A-B）流式分析 Il-10 WT 或者 Il-10 KO EGFP-Spp1-敲入报告小鼠 MI 后三天 CD11b+ Ly6G − 细胞中 GFP 的表达，如图 A 散点图所示。图 B 条形图说明 CD11b+ Ly6G − 细胞中 GFP+表达的比例；（C-I）在 EGFP-Spp1-敲入报告小鼠的腹腔注射 IgG、白介素-10 以及白介素-10+M-CSF 抗体。直方图代表心肌 CD11b+ Ly6G − 细胞中 pSTAT3 (Y705)的表达；图 C 流式分析不同抗体处理 F4/80+ CD11b + Ly6G − 细胞中半乳糖凝集素-3 以及 MerTK 的表达；图说明F4/80+ CD11b + Ly6G − 细胞中半乳糖凝集素-3 hi MerTK 的表达；图 E 条形图说明 F4/80 + CD11b + Ly6G − 细胞中半乳糖凝集素-3 hi MerTK+F4/80 + CD11b + Ly6G − 细胞的数量；图 F 说明每毫克半乳糖凝集素-3 hi MerTK 中的细胞数量；图 G表示 F4/80+ CD11b + Ly6G − 中 Spp1-GFP 的表达；图 H 条形图说明 F4/80 + CD11b + Ly6G − 细胞中 Spp1-GFP 表达的比例；图 I 条形图说明每毫克 GFP+F4/80+ CD11b + Ly6G − 细胞中的细胞数量；流式细胞分析至少进行了 3 次独立实验，数据是均值±SEM，*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001，EGFP 表示增强型绿色荧光蛋白，GFP 表示绿色荧光蛋白，M-CSF 表示巨噬细胞克隆刺激因子，MerTK 是 Mer 酪氨酸激酶，MI 表示心肌梗死，pSTAT3 表示磷酸化的信号转导和转录激活因子 3，rIL 表示重组白介素。

　1 6 Spp1 的转录活化需要 2 ERK1/2 的活化

　研究者之前报道称白介素-10-STAT3-半乳糖凝集素-3 轴线对于产生骨桥蛋白修复型巨噬细胞的极化非常关键。Colivelin 是一种能够活化 STAT3 神经保护肽。在 EGFP-Spp1 敲入小鼠BM 源性 CD11b+

　Ly6G − 细胞培养中利用 Colivelin 刺激后，能够显著诱导 STAT3 的活化以及半乳糖凝集素-3 的上调。然而 colivelin 并不能诱导这些细胞中 Spp1 的转录活性。

　除了 STAT3 的活化，ERK1/2 的活化对于活化巨噬细胞的分化非常关键。在 EGFPSpp1 敲入小鼠 BM 源性 CD11b+

　Ly6G − 细胞培养中 rIL-10 能够激活 ERK1/2，但是 rIL-4 并不能活化 ERK1/2。

　rIL-10 和 rM-CSF 共刺激能够显著活化 ERK1/2（图 6A），ERK1/2 的抑制剂 SCH772984 能够显著抑制 rIL-10 和 rM-CSF 诱导的 ERK1/2 活化（图 6B）；Spp1 的转录活性也受 SCH772984 抑制（图 6C）。SCH772984 并不影响 STAT3 的活化或者半乳糖凝集素-3hi

　MerTK + 亚群的分化（图6E）。然而 rIL-10 和 rM-CSF 共刺激导致的 ERK 活化并不受 Stattic 对 STAT3 活性的抑制或者Lgals3 或者 MerTK 敲除的影响。当用 rIL-10 和 rM-CSF 共刺激时，Spp1 敲除小鼠源性CD11b+

　Ly6G − 细胞 ERK1/2 活化的水平与 WT 小鼠源性 CD11b +

　Ly6G − 细胞中相似。

　 图 6. ERK1/2 的磷酸化调节体外 OPN 的表达。（A）CD11b+ Ly6G − 细胞取自 8-10 周 WT 小鼠骨髓并且在 rIL-10 或者 rIL-10+rM-CSF 条件下培养 3 天；图 A 条形图说明 CD11b+Ly6G−细胞中 pERK1/2 (Thr202/Tyr204)的表达；(B-E) CD11b+ Ly6G − 细胞取自 8-10 周 WT 小鼠的骨髓并且在 rIL-10+rM-CSF+DMSO、rIL-10+rM-CSF+SCH772984 (ERK1/2 抑制剂)、或者 DMSO 条件下培养 3 天；图 B 条形图说明 CD11b+ Ly6G − 细胞中 pERK1/2 (Thr202/Tyr204)的表达；图 C 散点图表示 EGFP-Spp1 的表达；图 D 条形图说明 EGFP-Spp1 的比例；图 E 条形图说明 CD11b+ Ly6G− 细胞中半乳糖凝集素-3 hi

　MerTK + 表达的比例。流式细胞分析至少进行了 3 次独立实验，数据是均值±SEM， ***P<0.001，n.s.表示没有显著性差异，EGFP 表示增强型绿色荧光蛋白，GFP 表示绿色荧光蛋白，ERK 表示细胞外信号调节激酶，M-CSF 表示巨噬细胞克隆刺激因子，MerTK 是 Mer 酪氨酸激酶，MI 表示心肌梗死，pERK表示磷酸化细胞外信号调节激酶，rIL 表示重组白介素。

　MI 后心肌巨噬细胞中 ERK1/2 体内活化发生在第三天，在假手术中并未发现（图 7A 和 7B）。研究者在 MerTK+ 半乳糖凝集素-3 hi 巨噬细胞中观察到 ERK1/2 的活化。在 EGFP-Spp1 敲入报告小鼠中诱导 MI 后，向腹腔注射 SCH772984 能够在心肌巨噬细胞中抑制 ERK1/2 的活化（图 7C 和7D）。ERK1/2 的抑制并不影响 STAT3 的磷酸化或者 MerTK+ 半乳糖凝集素-3 hi 在所有心肌巨噬细胞中的比例（图 7E 和 7F），但是 SCH772984 对 ERK1/2 的抑制能够显著抑制 Spp1 的转录活性（图 7G-7I）。另一方面，Stattic 的处理并不影响 MI 后心肌巨噬细胞中 ERK1/2 的活化。将白介素- -0 10 和 和 M M- -F CSF 中和抗体共处理能够抑制 I MI 后心肌巨噬细胞中 2 ERK1/2 的活化。

　在 Spp1 敲除小鼠或者 WT 小鼠心肌巨噬细胞中 ERK1/2 磷酸化并没有差异。因此 白介素- -0 10 和M M- -F CSF 能够不依赖于 3 STAT3 协同活化 ERK1/2 ，这种不依赖于 3 STAT3 的 的 2 ERK1/2 活化信号通路对于 于 I MI 后 后 MerTK+ 半乳糖凝集素- -i 3hi 巨噬细胞的转录激活是非常重要的。

　 图 7. ERK1/2 磷酸化调节体内骨桥蛋白的表达。（A）直方图说明假手术或者 MI 后三天 F4/80+ CD11b+ Ly6G −细胞中 pERK1/2 (Thr202/Tyr204)的表达；（B）条形图说明 F4/80+ CD11b + Ly6G − 细胞中 pERK1/2(Thr202/Tyr204)表达的比例；（C-I）

　MI 前 1 天到 MI 后三天，EGFP-Spp1 敲入报告小鼠腹腔注射 DMSO 或者 SCH772984 (ERK1/2抑制剂)，图 C 流式直方图表示 DMSO 或者 SCH772984 处理 F4/80+ CD11b + Ly6G − 细胞中 pERK1/2 的表达；图 D 条形图表示 F4/80+ CD11b + Ly6G − 细胞中 pERK1/2 (Thr202/Tyr204)表达细胞的比例；流式分析 MI 后 DMSO 或者SCH772984 处理 F480+ CD11b + Ly6G − 细胞中半乳糖凝集素-3 和 MerTK 的表达，图 E 散点图表示 F4/80 + CD11b + Ly6G −细胞中半乳糖凝集素-3hi

　MerTK 的表达；图 F 条形图说明 CD11b+ Ly6G − 细胞中半乳糖凝集素-3 hi

　MerTK 的比例；图 G 散点图说明 F4/80+ CD11b + Ly6G − 细胞中 GFP-MerTK+的表达；图 H 条形图说明 F4/80 + CD11b + Ly6G − 细胞中Spp1-GFP+的比例；图 I 条形图表示每毫克 Spp1-GFP+F4/80+ CD11b + Ly6G − 细胞的数量。流式细胞分析至少进行了3 次独立实验，数据是均值±SEM，**P<0.01, ***P<0.001，n.s.表示没有显著性差异，EGFP 表示增强型绿色荧光蛋白，ERK 表示细胞外信号调节激酶，MerTK 是 Mer 酪氨酸激酶，MI 表示心肌梗死，pERK 表示磷酸化细胞外信号调节激酶。

　7 重组 M M- -F CSF 能够通过产生 N OPN 巨噬细胞的分化加速梗死修复

　为了检测 rM-CSF 治疗能否通过诱导产生骨桥蛋白巨噬细胞的分化加速梗死修复，研究者利用 rM-CSF 或者对照处理了 MI 后 EGFPSpp1 敲入报告小鼠 0-3 天。rM-CSF 提高了 MI 后F4/80+ CD11b + Ly6G − 细胞中半乳糖凝集素-3

　hi MerTK + 以及产生骨桥蛋白亚群细胞的比例和数量（图8A-8C）。在第三天梗死的心肌层中，用 rM-CSF 处理的小鼠 Spp1 和 Col1a1 的基因表达升高（图 8D-8E）。组化分析证实 rM- -F CSF 能够促进梗死心肌的纤维化，超声心动图分析也说明梗死心肌心室间隔膜厚度增加。尽管左心室舒张末期容积和左心室收缩末期容积之间无显著差异，但是在 rM-CSF 组中左室舒张末期容积和左心室收缩期末体积变小。这些证据与之前的报道一致。组化分析证实 MI 后第七天，在 rM-CSF 处理的小鼠中产生骨桥蛋白的细胞比对照组多（图 8F）。此外，rM-CSF 处理的梗死心肌中 TUNEL 阳性的细胞数量更少（图 8F 和 8G）。因此，MI 后 M-CSF 的治疗是一项具有前景的策略，能够加速心肌组织的修复。

　 图 8. M-CSF 治疗通过诱导骨桥蛋白产生巨噬细胞的分化改进心肌修复。（A-F）MI 后 0-3 天对 EGFP-Spp1-敲入报告小鼠腹腔注射对照试剂或者 rM-CSF，图 A 和图 B 分别采用条形图展示了 MI 后 F4/80+ CD11b + Ly6G − 细胞Spp1-GFP+细胞的比例和每毫克的细胞数量；图 C 条形图说明 MI 后 F4/80+ CD11b + Ly6G − 细胞中半乳糖凝集素-3 hi MerTK 的表达；图 D 和图 E 分别展示了经对照或者 rM-CSF 处理 WT 小鼠 MI 后第三天 Spp1 和 Col1a1 的 mRNA表达水平；图 F 表示 EGFP-Spp1-敲入报告小鼠 MI 第 7 天利用组化鉴定的 TUNEL 阳性细胞；图 G 表示 MI 后 TUNEL

　阳性细胞的数量；图 H 图示揭示了 MI 后诱导产生骨桥蛋白的巨噬细胞分化相关的信号通路。数据是均值±SEM，*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001， EGFP 表示增强型绿色荧光蛋白，M-CSF 表示巨噬细胞克隆刺激因子，MerTK是 Mer 酪氨酸激酶，MI 表示心肌梗死，rM-CSF 表示重组巨噬细胞克隆刺激因子。

　 结论

　总之， 白细胞介素 0 10 和 和 M M- -F CSF 激活心肌梗死心脏巨噬细胞中的 3 STAT3 和 和 ERK 。

　活化的 3 STAT3 通过上调 galectin- -3 3 和 和 K MerTK 的表达诱导骨桥蛋白生成的巨噬细胞分化。

　因此，Spp1 转录活性需要激活 ERK 和 STAT3。尽管近年来 MI 的急性死亡率下降了，但 MI 后发展为心力衰竭的患者数量正在增加。因此， 刺激产生骨桥蛋白的 MerTK + Galectin- -i 3hi 巨噬细胞的分化和成熟可以抑制 I MI 后心脏重塑并通过促进最佳伤口愈合来预防心力衰竭的发作。