【ＤＯＣ－１基因的原核表达载体构建及其重组蛋白的表达纯化】原核基因载体构成

　　[摘要]目的：克隆DOC一1基因、构建原核表达载体并纯化出其重组蛋白。方法：从人胎脑组织中提取总RNA，经逆转录－聚合酶链式反应(RT―PCR)扩增DOC－1的CDS序列，再通过基因重组技术将该基因片段依次克隆到pMD18-T和pGEX-4T-1载体中，构建融合表达载体pGEX-4T-1-DOC-1，经酶切、测序鉴定后，用该重组质粒转化E.coliBL21，用IPTG诱导表达，OlutathioneSepharose 4B柱亲和层析纯化重组蛋白。结果：电泳证实RT-PCR扩增产物与预期目的基因DOC－1长度一致，测序结果与GenBank公布的DOC－1基因序列完全一致，IPTG诱导后经SDS―PAGE电泳分析表明，在相对分子质量38000左右出现新的蛋白表达条带，经亲和层析柱纯化后得到高纯度的GST-p12重组蛋白。结论：成功构建了pGEX-4T-1－DOC－1原核表达载体，表达并纯化出GST－p12重纽蛋白，为进一步研究p12DOC-1蛋白打下了实验基础。
　　[关键词]p12DOC-1；蛋白；口腔癌缺失；基因克隆；基因表达
　　[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008－6455(2007)04―0447―03
　　
　　癌症作为一类严重威胁人类生命的疾病，已成为医学研究关注的重要课题。口腔癌和身体其他部位癌一样，其发生、发展亦涉及癌基因的激活和抑癌基因的失活。DOC－1基因是Todd等(1995)利用叙利亚仓鼠口腔颊癌模型分离的正常和恶性角化细胞进行细胞杂交实验分离和证实的一个候选抑癌基因，作为一个候选抑癌基因它具有以下几个特点：恶性角化细胞杂合性缺失；与正常上皮相比恶性上皮中DOC－1表达降低；DOC－1的转入抑制肿瘤细胞的生长；经转染DOC－1 cDNA的恶性角化细胞在动物模型中逆转了恶性表型。p12蛋白作为其编码的蛋白因子，具有抑制DNA复制，从而抑制恶性角化细胞的生长，使其表型改变的功能，近来已逐渐成为研究的热点。为了开展对DOC－1的研究，进一步了解其功能及其在口腔鳞状细胞癌中表达缺失机制中的作用，本实验通过RT―PCR获得DOC－1的eDNA编码区序列，并且构建了其克隆表达载体，在大肠杆菌中实现了p12DOC－1重组蛋白的高表达，为以后的工作打下了实验基础。
　　
　　1　材料
　　
　　1．1　质粒、菌株和标本：pMD18-T和pGEX-4T-l载体质粒、E.coli (DH5 a和BL21)、7个月的人胚胎脑组织，均由中科院遗传与发育生物学研究所戴建武实验室惠赠。
　　1．2 工具酶和试剂盒：各种限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶、T载体试剂盒、TaqDNA聚合酶、M-MLV反转录酶、O1igo(dT)均购自Takara公司，IOObpDNA ladder marker购自北京天为时代生物公司，蛋白分子量marker购自fermentas公司。总RNA提取试剂盒TRIZOL购自Invitrogen公司。质粒DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒均购自OMEGA公司。
　　1．3 试剂及引物合成：一般化学试剂均为国产分析纯，Glutathione Sepharose 4B购自AmershamBiosciences公司。PCR引物合成及测序均由上海生工生物技术有限公司完成。
　　
　　2　方法
　　
　　2．1　RT―PCR扩增DOC－1基因及基因重组与鉴定：按TRIZOL试剂盒说明提取7个月人胚胎的脑组织的总RNA，先反转录为cDNA，再以此为模板进行PCR，上下游引物分别为5’ATGTCTTACAAACCGAACTTGGCC3’和5’CTAGGATCTGGCATTCCGTTC 3’。反应体系共25μl，扩增程序：94℃ 5min；94℃ 40s；56℃ 40s；72℃ 50s；共循环34次；最后在72℃维持10min。取5μl反应产物进行1.2％的琼脂糖凝胶电泳，鉴定扩增产物；回收相应大小的PCR产物后与pMDl8-T载体连接，转化大肠杆菌(DH5a)感受态细胞，构建pMDl8-T-DOC-1载体质粒。用菌落PCR进行初步鉴定，将能扩增出目的基因片段的质粒送上海生物工程公司测序。
　　2．2 原核表达载体pGEX-4T-1-DOC-1的构建：以测序后含DOC-1编码区序列的质粒为模板，在前一对引物的基础上再分别设计含酶切位点的上下游引物分别为5’CGCCGGTCCATGTCTTACAAACCG3’和5’CCGCTCGAGCTAGGATCTGGCATT3’，其中上游含BamH Ⅰ酶切位点，下游含Xho Ⅰ酶切位点，扩增含有酶切位点的DOC-1编码区序列。回收并纯化PCR产物后用BaraH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切，表达载体pGEX-4T-1也用同样的酶消化后回收并纯化。将两种双酶切后的产物进行连接，转化到大肠杆菌(DH5 α)中，然后用双酶切鉴定并再次测序，得到重组的表达质粒pGEX-4T-1-DOc-1。
　　2．3 重组蛋白的原核表达：将含pGEX-4T-1-DOC-1的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，挑选阳性的单克隆菌落接种到含AMP+的LB培养基中，在37℃的摇床培养过夜，次日将培养的菌液按1:50的比例加入到新的含AMP+的IJR培养基中继续在37℃的摇床培养至对数生长期，加入IPTG至终浓度为0.1mmol/L，在37℃摇床进行诱导表达2h、3h、4h，不加IPTG的作为阴性对照。离心收集菌体，超声波破碎细胞后，将上清与沉淀分别行SDS-PAGE电泳鉴定表达产物。
　　2．4 重组蛋白的纯化与鉴定：取阳性克隆菌液4ml接种到200ml的含AMP+的LB培养液中，用同样的方法在IPTG诱导4h后，12000g离心收集菌体。取20ml的lmmol/LPBS重悬菌体，在冰上超声5s，间歇5s共进行10min，然后离心收集上清并将上清过Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化，按Amersham Biosciences公司的操作手册进行，分别用2.5、5、10mmol/L的GSH进行洗脱，将洗脱液行SDS―-PAGE鉴定GST-p12融合蛋白的洗脱情况。
　　
　　3　结果
　　
　　3．1　RT-PCR扩增DOC－1基因的蛋白质编码序列：RT―PCR产物经1.2％的琼脂糖凝胶电泳后，可见在人胚胎的脑组织中扩增出大小约为348bp左右的单一片断，与目的蛋白编码的基因(523―870位)大小一致，测序结果与人的DOC-1基因中CDS序列(GenBank NM-004642)一致。 　　3．2 重组表达载体的构建与鉴定：从转化了重组质粒的DH5α菌株中提取质粒，用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ进行双酶切鉴定，可见电泳中有一约348bp左右的目的基因片断和一大分子量的载体片断，测序结果也显示与人的DOC-1基因中CDS序列(GenBank NM-004642)一致。
　　3．3 重组蛋白的原核表达鉴定：SDS―PAGE分析结果显示，经IPTG诱导的含重组质粒的E.coliBL21在相对分子量38000左右的位置上出现一条新的条带。
　　3．4 重组蛋白的纯化：超声破碎菌体并离心后，分别取裂解液上清与沉淀进行SDS―PAGE，显示目的蛋白主要在上清中表达。将上清过GlutathioneSepharose 4B亲和层析柱纯化并用lOmmol/L的GSH洗脱下大部分目的蛋白。
　　
　　4 讨论
　　
　　 肿瘤的基本特征是细胞的失控性生长，包括细胞的程序性死亡(或凋亡)的减少、增殖的增加以及细胞的去分化等多种细胞生命活动。抑癌基因在控制细胞生长、增殖及分化过程中起着重要的负调控作用，并能抑制肿瘤生长。Sherr的研究提示表达外源性p12DOC-1蛋白的恶性角化细胞的增殖周期明显延长可能与细胞周期调控蛋白和激酶相关。Shintan等通过体外实验筛选了CDK家族的7个成员，证明了p12DOC-1蛋白与CDK2的紧密联系，认为p12DOC-1蛋白为CDK2的分子伴侣。Hu等近期利用建立的p12DOC-1蛋白表达缺陷HaCaT细胞系研究发现：该细胞系中CDK2相关激酶活性增加；pRb磷酸化；部分逆转了TGF―β―1对CDK2相关激酶活性、pRb磷酸化、细胞增殖的抑制。研究还发现TGF―α―1可以诱导p12DOC-1蛋白的表达，也可以说p12DOC-1蛋白通过CDK2介导了TGF-β―1的生长抑制活性。
　　DOC-1基因在人体组织心、脑、肝、胰、肺、骨骼肌、胎盘、肾中均可以检测到，因此我们选择流产胎儿的脑组织提取总RNA，然后根据GenBank(NM-004642)提供DOC-1全长基因序列先设计不带酶切位点的引物，以保证扩增完整序列的成功率再测序确认，并将基因克隆入T载体上，再在前次设计的引物基础之上，设计出带酶切位点及保护碱基的引物，直接从T载体上扩增目的基因。实验证实均一次扩增成功，设计两种引物并不繁琐、费事，反而提高了实验的成功率，节省了时间。表达载体选用pGEX-4T-l，该载体在E.coli中表达重组蛋白是很常用的，因表达的融合蛋白连有GST标签，可以与谷胱甘肽琼脂糖进行特异性的结合，然后应用还原型谷胱甘肽进行洗脱纯化。虽然上清中的可溶性蛋白含有少量的GST蛋白，但人体中并没有编码GST蛋白的基因，同时经过不同浓度的还原型谷胱甘肽可以洗脱掉大部分的GST蛋白，从而得到较高纯度的含目的基因的重组蛋白。在GST的C端有凝血酶特异识别的切割位点，其下游有多克隆位点，可插入外源基因，两个基因表达产物即为融合蛋白，也可通过凝血酶进行切割分离将GST蛋白部分切除得到单一的p12DOC-1目的蛋白。而且融合表达载体可以提高相对分子量，增加蛋白质的稳定性；也可提高p12DOC-1蛋白对动物肌体的免疫原性，为下一步制作抗体打下基础。
　　本实验通过酶切鉴定和序列测定，证明了基因的合成和表达载体的构建完全正确。通过IPTG诱导表达，以Glutathione sepharose 4B亲和层析柱纯化，经SDs―PAGE分析表明GsT―p12重组蛋白的表达与纯化是成功。