缺血后处理对保护皮瓣的作用机制研究:皮瓣缺血

　　[摘要]目的：缺血后处理已经在心、肾等器官上广泛应用，进行相关研究进一步探究缺血后处理对皮瓣有否保护作用。方法：健康成年新西兰大白兔，分为3组。A组为给予缺血后处理；B组为再灌注前5min给予A2A阻滞剂 SCH58261+缺血后处理。C组，直接应用微血管夹阻断腹壁浅血管持续缺血6h后，恢复正常血供。分别进行中性粒细胞浸润，MPO含量和皮瓣存活率检测。结果：新西兰大白兔完全存活。B、C组相比较，中性粒细胞计数以及MPO含量也未见统计学差别（P>0.005）。实验组皮瓣存活面积比较，B与C相比较，无统计学意义(P>0.005），但是A与B、C相比较，上述指标两两之间都有统计学意义差别(P0.005）.No difference was found about the skin flap survival. But about the above three parameters,A group was found to have significance between B and C group.ConclusionIschemia postconditioning can protect the skin flap which may be attributed to the role of the A2A receptor.
　　Key words:skin flap;ischemia-reperfusion injury;A2A receptor
　　
　　自2003年Zhao 等提出缺血后处理( ischemiapostconditioning) 的概念以来，缺血后处理提高组织对缺血的耐受性、减轻组织缺血再灌注损伤的作用已在全身的多个器官通过动物和临床的证据证实[1-3]。但是缺血后处理对皮瓣作用尚未经证实，进行相关研究探究缺血后处理对皮瓣的保护作用。
　　
　　1材料和方法
　　1.1 动物模型的建立：选用健康成年新西兰大白兔32只,雌雄不限,体重2.5～3.5kg。腹腔内注射异戊巴比妥钠麻醉，仰卧位固定于实验台上，腹部备皮，制备左侧腹股沟皮瓣约4cm×8cm，保留腹壁浅血管备用。
　　1.2 实验方法与分组：模型建立后,实验动物随机分为3组。对照组为C组，直接应用微血管夹阻断腹壁浅血管持续缺血6h后，恢复正常血供；实验组持续缺血恢复灌注后即给予短暂的缺血再灌注处理（10s缺血+10s再灌注为一个疗程，共6个疗程，持续2min）。根据处理方式的不同分为2个亚组：A组为给予缺血后处理；B组为再灌注前5min给予腹壁浅静脉给予A2A阻滞剂 SCH58261 10mg缺血后处理。各组处理后实验步骤与对照组相同；每组8只。实验期间，烤灯保温，无明显血管痉挛现象。
　　1.3 标本收集与检测：每组兔子恢复血流4h后， 取2只处死，切取皮瓣组织(1～2g)标本用4% 甲醛固定，HE 染色镜下观察。病理切片分析，200倍视野下计数中性粒细胞浸润数目，每组计数2张切片，每片计数10个视野。将皮瓣按重量体积比例制备成组织匀浆，按照试剂盒说明书进行具体步骤操作，采用分光光度法在460nm处检测各管OD 值，运用公式（测定管OD 值-对照管OD值/11.3×取样量）计算MPO活性数值。其余6 只动物于术后第7 天判断皮瓣成活情况，计算皮瓣成活面积的百分比。
　　1.4 统计学方法：采用SPSS1110 统计软件包进行统计学处理, 数据以均数±标准差表示。实验组与对照组比较采用t检验，P0.05）。但是A与B、C相比较，两两之间都有统计学意义差别（P0.05）（见表2和图3）。
　　3讨论
　　3.1 如何预防和减轻组织缺血再灌注损伤是当前医学研究的重要课题之一。缺血后处理通过一次或多次短暂缺血，再灌注过程而减轻组织缺血再灌注损伤的发生应用于再灌注早期的新的机械性干预措施,具有可预知性和可控制性的特点,而且其在临床上应用简单、方便、可行, 易为外科医生所接受。虽然缺血后处理在心，肝和肾中作用已被广泛证实[4-7]。但是对皮瓣保护作用仍然尚未证实。
　　3.2 缺血再灌注损伤的进一步研究认为再灌注损伤本质是炎症反应，是内源性的细胞因子和炎性介质等引起的级联式炎症反应。通过信号分子的逐级转导，炎症反应瀑布型放大，引起再灌注损伤的迅速加重直至衰竭。在再灌注损伤初期中断炎症反应的发生成为保护组织的关键。缺血后处理对组织保护作用机制目前被广泛研究，其中涉及到机制有：①抑制细胞凋亡学说。细胞凋亡主要通过两条途径, 即死亡受体途径和线粒体途径。沈诚发现缺血后处理的心肌细胞能耐受缺血缺氧的损伤，心肌细胞的凋亡指数明显降低[8]；②自由基清除：万芳发现后适应能升高脑缺血再灌注大鼠脑匀浆中SOD,还原型谷胱甘肽( reduced glutath ione,GSH)含量,加快清除组织超氧阴离子自由基，使脂质过氧化产物丙二醛含量显著下降[9]；③改善微循环：缺血后适应后血流灌注量增加, 细动静脉收缩、血流速度减慢和白细胞滚动、贴壁程度减轻[10]。
　　3.3 我们的研究着重探讨缺血后处理对新西兰大白兔腹股沟皮瓣再灌注损伤的影响并且研究A2A受体在缺血后处理保护皮瓣机制中作用。A2A受体活化被认为是机体内一种最有力的内源性抗炎信号，它大量表达于单核/巨噬细胞、树突状细胞、肥大细胞、中性粒细胞、内皮细胞、嗜酸粒细胞、上皮细胞,以及淋巴细胞、自然杀伤细胞和自然杀伤T细胞。A2A受体活化能够抑制免疫应答过程早期和末期反应,包括抗原提呈、共刺激、免疫细胞转运及增殖、致炎细胞因子释放和细胞毒性反应,腺苷A2A 受体抗炎轴能被用作治疗缺血性和炎症性组织损伤的内源性手段[11-12]。
　　3.4 我们测定了各组皮瓣组织中MPO 的含量和中性粒细胞浸润程度。中性粒细胞黏附和浸润是皮瓣缺血后炎症反应的核心。MPO 是中性粒细胞嗜天青颗粒产生的一种重要的过氧化物酶，主要存在于中性粒细胞中，可作为中性粒细胞的特异性标记物，利用其可使过氧化氢还原的能力分析该酶的活力，既可定量测定中性粒细胞的数目，反映中性粒细胞的浸润情况，又可定量反映炎性损伤的程度。
　　A组中中性粒细胞计数和MPO含量明显高于B和C组。皮瓣的成活面积也增加。显示缺血后处理对腹股沟皮瓣有效，而且这种保护皮瓣作用可被A2A受体阻滞剂阻断，显示缺血后处理保护作用和A2A受体有关。A2A受体作用可能和其抗炎作用有关。但是具体保护机制尚不清楚，还有待进一步研究。
　　
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　　[收稿日期]2010-11-28 [修回日期]2011-02-22
　　编辑/张惠娟