缺氧诱导因子【缺氧诱导因子1α对慢性创面愈合影响的研究进展】

　　体表慢性创面(俗称溃疡) 是由一系列创伤和疾病所致,国内外一般将持续一个月不愈合创面定义为慢性创面。慢性创面具有病程长、对外观影响大、并发症多等特点,近年来有逐年增加的趋势,成为影响患者生活质量的重要并发症,已引起世界各国的高度重视[1]。慢性创面愈合困难与创面的缺氧(hypoxia)和感染密切相关[1-2]。缺氧诱导因子1(hypoxia inducible factor 1,HIF-1)在缺氧缺血性疾病的发生发展中具有重要作用,其下游靶基因涉及细胞能量代谢、离子代谢、血管形成、细胞凋亡和增殖、细胞迁移等多个方面[2-3],在创面愈合过程中发挥了重要作用。现就HIF-1结构功能及其在慢性创面愈合过程中的作用研究进展做一综述。
　　
　　1体表慢性创面的国内外研究现状
　　体表慢性难愈合创面发生机制复杂,至今尚未完全阐明。体表慢性创面的发生可能与缺血、缺氧、营养、感染、生长因子浓度失衡、内分泌及神经免疫等因素有关。近两年人们更加关注创面修复的信号转导机制,尤其是细胞的缺氧应答反应对愈合的影响机制。在创面愈合过程中,因为氧的需求增加、周围血管循环障碍、感染、局部炎性细胞消耗大量的氧用于呼吸爆发等原因,创面局部处于缺氧状态。正常创面愈合时,局部暂时的缺氧有利于血管发生和愈合,随着创面愈合局部缺氧状况得到矫正[2]。研究发现慢性创面局部存在持续的缺氧和新生血管形成障碍,研究者认为这是慢性创面延迟愈合的重要原因[2-4]。
　　血管内皮生长因子(VEGF)是目前发现的机体内最主要的血管生长因子之一,缺氧通过增加VEGF表达从而促进血管生成。应用生长因子可以促进血管生成和创面愈合,但是各种促血管生成的生长因子仍然存在一些问题,如保存困难、新生血管质量差、治疗费用大等问题。而高压氧治疗虽然可以矫正创面缺氧,对部分慢性创面有一定治疗效果,但是存在全身性的氧毒性以及设备重、费用贵等缺点。因此,人们多年来一直在试图深入探寻创面愈合的内在机制及其影响因素。最近发现缺氧诱导因子1(HIF-1)是参与缺氧应答反应的关键性转录因子,能够调节VEGF的表达,对创面愈合至关重要[3],已成为慢性创面愈合研究中的新热点[2-15]。HIF-1由HIF-1α和HIF-1β构成,其活性主要由HIF-1α决定,受氧浓度的调节。
　　在正常创面愈合中,缺氧能导致HIF-1α表达升高,从而促进血管生成和伤口愈合。最近研究发现烧伤、糖尿病、使用糖皮质激素、老年等慢性创面中均存在HIF-1的表达减少,这些研究者认为HIF-1表达不足导致的血管生成减少是创面延迟愈合的重要原因[4-14]。在老年鼠的慢性缺血缺氧创面模型的研究中发现内皮祖细胞[8]和巨噬细胞[11]的数量和功能未见异常,创面局部HIF-1表达减少导致创面愈合延迟,HIF-1表达减少的原因未明。在糖尿病患者中,高血糖产生的糖基化产物可能是抑制HIF-1表达的机制之一[6]。但是,其他慢性创面中HIF表达的调控机制未见深入研究。因此,慢性创面中影响HIF-1表达的机制有待进一步研究。
　　
　　2HIF-1的结构、作用机制和功能调节
　　2.1 HIF-1α的结构:HIF-1是异二聚体的转录因子,由氧敏感的HIF-1α亚基和在核内稳定表达的HIF-1β亚基组成, HIF-1α在细胞浆内表达,受氧浓度的调节,HIF-1的活性主要由HIF-1α决定。HIF-1α含有以下结构[16]:①位于氮末端的碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)/Per-Arnt-Sim基本结构,主要参与HIF-1α与靶基因DNA 结合以及与HIF-1β的二聚化;②中部是氧依赖性降解域(oxygen dependent degradation domain,ODDD),在正常氧浓度下,ODDD内部第402位和第564位脯氨酸残基可被脯氨酸羟化酶(prolyl hydroxylase domain proteins, PHD)羟化,使HIF-1α被泛素连接酶所识别并结合,并通过泛素化-蛋白酶体途径被降解;③碳末端有2个反转录区,氮末端转录激活结构域和碳末端转录激活结构域(C-transcriptional activation domain,C-TAD)。
　　2.2 HIF-1α作用机制:HIF-1α广泛参与哺乳动物细胞中缺氧诱导产生的特异应答,是缺氧引发的体内一系列适应反应的中心环节。在低氧环境中,它介导缺氧诱导基因的调控,使缺氧诱导基因的转录增强,表达产物增多,从而产生一系列的生理效应。被HIF-1α诱导的基因有一些共同特点,在其启动子或增强子中含有HIF-1α结合位点,其核心序列为5"-RCGTG-3",称为缺氧反应元件(hypoxia-responsive element, HRE)[17]。目前的研究认为HIF-1的表达和活性调节表现在基因转录水平和蛋白水平:①增加HIF-1α的转录;②增加HIF-1α的稳定性[18]。研究表明,HIF-1α的表达受缺氧和非缺氧两种途径介导,HIF-1α表达上调能增加供血、供氧及供能[19]。HIF-1α的作用机制[20]是在缺氧条件下,激活的HIF-1α与其靶基因HRE中的HIF-1结合点结合,促进其转录,从而引起细胞对缺氧的反应,其过程包括:①HIF-1α的核转位:而在低氧环境中,HIF-1α却大量集聚并转移至细胞核中,此过程称作核转位;②HIF-1的激活:HIF-1α和HIF-1β聚合后,α亚基的C端的转录激活域(TAD)介导HIF-1的激活;③转录起始复合物的形成和转录激活:活化的HIF-1在缺氧诱导基因的转录起始部位形成转录起始复合物,从而启动靶基因的转录。它的靶基因主要有[21]:①通过扩血管效应和新的血管网的构建来调节局部组织的氧供的基因,如:诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、内皮素1( ET1)、血管内皮生成因子及其受体(Vascular endothelial growth factor, VEGF、VEGFR)等;②增强细胞对葡萄糖的摄取能力和无氧酵解能力的基因,如:葡萄糖转运体1和3、乳酸脱氢酶A、丙酮酸激酶M;③促进红细胞增殖,提高血液携氧量的基因,如:促红细胞生成素(erythropoietin, EPO)、转铁血红蛋白及其受体等。
　　2.3HIF-1功能调节
　　2.3.1 缺氧途径介导HIF-1α的表达:缺氧是HIF-1生理性表达最主要的调节因素,主要是通过调节HIF-α亚基来完成。常氧状况下细胞质内持续地合成HIF-α亚基蛋白质,但由于降解迅速因而很难检测到。这种降解是氧依赖性的,有赖于其ODDD区特定脯氨酸残基被PHDs羟基化,羟基化后的HIF-α可与肿瘤抑制蛋白pVHL结合,经泛素化-蛋白酶体途径被降解[20]。另外,天冬酰胺羟化酶就是原来认为的HIF-1α抑制因子(factor-inhibiting HIF-1α, FIH-1),在常氧下,FIH可将HIF-1α亚基C-TAD序列内的天冬氨酸残基羟化,阻断HIF-1α亚基与转录共激活蛋白如:P300、CBP等的结合,从而使HIF-1α失去促进HIF转录的能力。PHDs及FIH均是HIF-α氧依赖性降解的限速酶。它们的活性均是氧依赖性的,受氧浓度的调节。随着氧浓度的下降,PHDs和FIH依次失活,HIF-1α在细胞内的蛋白表达水平升高,核转位增加,识别靶基因的缺氧反应基因,并调节它们的活性[22]。
　　2.3.2非缺氧途径介导的HIF-1α的表达:PI3K(phosphatidylinositol 3-kinase)/Akt (protein kinase B)/mTOR(mammalian target of rapamycin)信号途径及MAPK (mitogen activated protein kinase)途径都能在常氧下增强HIF-1α的转录活性[19]。无论是否缺氧,MAPK信号传导都能增加内源性HIF的活性,亦能增加HIF的转录活动。HIF-α可以被MAKP途径直接磷酸化,但是,具体涉及的氨基酸残基尚不清楚。进一步研究表明,MAPK在P300的反式激活上有重要影响。纯化P300TD(aa1572-2370)可以迅速为MAPK所磷酸化,说明P300TD是MAPK的直接底物[22]。p300和CBP参与一系列信号转导,调节特定基因表达,影响细胞增殖、分化及内环境氧稳定。其机制可能与HIF-1α的C-TAD及FIH有关[6]。
　　生长因子和某些金属阳离子能调节HIF-1α的活性[20]。内皮生长因子、胰岛素样生长因子1和2(insulin-like growth factor-1,2;IGF-1,2)、血管紧张素、凝血酶、血小板衍生生长因子等,可以影响HIF-1α的活性。常氧状态下,内皮生长因子通过激活PI3K/Akt途径增加HIF-1α的合成[19]。IGF-1和IGF-2能诱导HIF-1α蛋白的表达,而HIF-1α反过来促进两者结合蛋白1、2、3的表达。目前认为,IGF-1通过促丝裂原激活的蛋白激酶影响HIF-1蛋白的磷酸化,从而影响HIF-1蛋白合成。铁、镍、钴、锰等二价化合物及其离子螯合作用、部分氧化剂、汞撒利可以促进HIF-1α的激活。铁离子螯合剂、钴、镍等可与HIF-1α上的铁离子发生作用而抑制HIF-1α的降解。汞撒利的作用机制可能与IGF-1和促丝裂原激活的蛋白激酶的活性有关。钙离子和钙调蛋白通过缺氧信号转导通路作用于细胞外信号调节激酶,从而增加HIF-1α的转录活性[22]。
　　诱导型一氧化氮合酶和一氧化氮能调节HIF-1α的活性。在生物体内存在三种亚型的一氧化氮合酶,分别是神经元型(nNOS)、内皮细胞型(eNOS)和诱导型(iNOS)。前两者在细胞内持续表达,其活性依赖于细胞内钙离子的水平,而iNOS主要是在病理的情况下受许多细胞因子诱导才表达[21],iNOS诱导产生大量一氧化氮,常氧下一氧化氮通过抑制脯氨酸羟化酶活性,减少HIF-1α的降解。缺氧时一氧化氮对HIF-1α的诱导与抑制是通过PI3K或促丝裂原激活的蛋白激酶信号通路来实现的。一氧化氮还可作用于缺氧反应基因,增加HIF-1α蛋白水平及活性从而激活VEGF启动子活性,并通过环磷酸鸟苷途径诱导VEGF基因的表达[20]。
　　最近几年发现的泛素样蛋白家族成员小泛素蛋白样修饰蛋白(SUMO)也能与HIF-1α共价结合。SUMO是一种分子量约为12kD的小蛋白,可共价结合许多靶底物蛋白,并对其进行翻译后修饰,该过程称为SUMO化。SUMO化修饰能在常氧和相对低氧的条件下调节HIF-1α蛋白的稳定性,从而改变其转录活性[22]。综上所述,在低氧途径中,主要是通过对蛋白的稳定性调节来控制HIF-1α蛋白水平的高低,而在非低氧途径中,则是通过直接调节HIF-1αmRNA表达水平或HIF-1α蛋白表达水平来实现调控。
　　
　　3展望
　　HIF-1作为一种核转录因子,在哺乳动物的生长发育、生理和病理反应过程中举足轻重。HIF-1α活性的调节,可能是慢性创面治疗新的切入点。不同时间和程度的缺氧对HIF-1表达的影响如何?HIF-1表达水平如何影响其下游基因及创面愈合?影响HIF-1活性的通路和每个通路的重要性等问题都还不清楚。因此,慢性创面中影响HIF-1表达的机制有待进一步研究。可以预见,在不久的将来,随着对HIF-1α调节通路更加深入的研究,会有良好疗效的HIF-1α调节剂应用于临床,促进慢性创面的愈合。
　　
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　　[收稿日期]2010-02-01 [修回日期]2010-03-24
　　编辑/李阳利