【地塞米松及碱性成纤维细胞生长因子联合应用防治超长任意型皮瓣缺血坏死的实验研究】 重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶

　　[摘要]目的：探讨联合应用地塞米松和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）对大鼠背部超长任意皮瓣成活的影响，并进一步探讨大鼠血清中TNF-α及皮瓣中内皮细胞的细胞间粘附分子1（ICAM-1）发挥作用的机制。方法：采用大鼠背部皮瓣模型，术后即刻腹腔内一次性大剂量注射地塞米松，皮瓣下均匀滴注bFGF，术后24h内观察TNF-α及ICAM-1的变化，术后7天观察皮瓣成活率及组织学变化。结果：皮瓣成活率联合用药组（58.2±5.2）%＞bFGF组（50.5±3.9）%＞地塞米松组（48.7±4.2）%＞对照组（39.5±3.7）%，（F=32.08，P＜0.01）；联合用药组与地塞米松组较对照组及bFGF组血清中TNF-α含量达高峰时间更晚，峰值更低，且各组均于术后24h下降明显；各组于术后4h皮瓣组织的上皮细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞的胞浆中均呈现ICAM-1的mRNA表达，并均于术后8h呈现ICAM-1阳性蛋白表达高峰， 对照组及bFGF组明显高于联合用药组和地塞米松组（P＜0.01），之后缓慢下降，术后12h仍保持较高水平。结论：地塞米松和bFGF均能促进皮瓣成活，且地塞米松+bFGF促进皮瓣成活优于单用地塞米松和单用bFGF。地塞米松能够延迟血清中TNF-α达到峰值的时间，显著降低其峰值含量，并通过抑制皮瓣中ICAM-1，干预炎症反应起始过程，从而减轻皮瓣炎症反应。
　　[关键词]地塞米松；碱性成纤维细胞生长因子；皮瓣；缺血坏死；成活率；TNF-α；ICAM-1
　　[中图分类号]R622[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2010）04-0591-04
　　
　　Experimental study of the application that Dexamethasone combined with basic fibroblast growth factor(bFGF) to prevent ischemia and necrosis from ultra-long radom skin flap
　　LIN Jie,QIU Shu-lin
　　(Department of Plastic Surgery,Hebei People’S Hospital,Shijiazhuang 050051,Hebei,China)
　　
　　Abstract:ObjectiveTo study the combined effects of Dexamethasone and basic fibroblast growth factor (bFGF) of the random flap survival on rat"s dorsal, and further explore the levels of TNF-α in serum and how is the mechanism that the intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) in endothelial cells of skin flap to play a role.MethodsThe rat dorsal skin flap model, a one-time immediately after high-dose intraperitoneal injection of Dexamethasone, drip bFGF equably under the flap, observed the changes of TNF-α and ICAM-1within 24h, post 7 days view the survival rate of the flap and histological changes. Results The survival rate of flap combined group (58.2 ± 5.2)%> bFGF group (50.5 ± 3.9)%> Dexamethasone group (48.7 ± 4.2)%> the control group (39.5 ± 3.7)%, (F = 32.08, P 　　
　　1材料和方法
　　1.1 动物来源及分组：健康Wistar大鼠（河北医科大学动物实验中心提供，体重280g±10g）96只，雌雄不限。大鼠背部超长任意皮瓣模型制备后，按术后即刻给药不同，将大鼠随机分为四组，即A组为对照组：腹腔注射生理盐水0.2ml，皮瓣下滴注生理盐水0.25ml；B组为地塞米松组：腹腔注射地塞米松0.2ml（用量为5mg/kg），皮瓣下滴注生理盐水0.25ml；C组为bFGF组：腹腔注射生理盐水0.2ml，皮瓣下滴注含1750IU bFGF的生理盐水0.25ml（用量为155IU/cm2）；D组为地塞米松联合bFGF组：腹腔注射地塞米松0.2ml，皮瓣下滴注含1750IU bFGF的生理盐水0.25ml。
　　1.2 大鼠背部超长任意皮瓣模型制备：96只大鼠均以2%戊巴比妥钠腹腔注射（35～40mg/kg）麻醉，麻醉满意后，背部脱毛，俯卧位固定，碘酒、酒精消毒。于鼠背正中以髂嵴连线为基准线，以后正中线为轴线，掀起一7.5cm×1.5cm大小的任意皮瓣（含脂膜肌层，长宽比5:1），其蒂在尾部。3-0丝线原位缝合皮瓣，B、D组术后即刻一次性腹腔注射地塞米松，C、D组术后即刻于皮瓣下均匀滴注 bFGF。A组给予生理盐水腹腔注射及皮瓣下滴注，时间方法同上。
　　1.3 观测指标及方法：①皮瓣大体观察：术后第7天对大鼠背部随意皮瓣成活的情况进行肉眼观察；②皮瓣成活率：坏死皮瓣以其外观、颜色及质地来判断,术后7天，用数码相机进行皮瓣摄像，图像输入计算机，应用Image-Pro Plus.v6.0图像分析系统，计算出皮瓣成活率（即皮瓣成活面积与总面积之比）；③组织学检查：术后3天和7天各组均于皮瓣中段取 0.5cm×0.2cm全厚皮瓣组织，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片、HE染色；a) 光镜下观察组织结构改变；b)进行毛细血管计数，血管计数方法：所有血管均计数在内，每组5张切片，每张切片在中央区及周边区随机选取5个高倍视野，血管计数后求其平均数；c) 进行成纤维细胞计数：每组5张切片，每张切片在中央区及周边区随机选取5个高倍视野，成纤维细胞计数后求其平均数；④ 检测血清中TNF-α含量：各组分别于术后0h、1h、4h、8h、12h、24h心脏取血，离心后取血清，用双抗体夹心ELISA法测定TNF-α含量；⑤细胞间粘附分子1（ICAM-1）免疫组化染色切片：术后4h、8h、12h各组均于皮瓣中段取 0.5cm×0.2cm全厚皮瓣组织，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，免疫组化染色，光镜观察ICAM-1的分布部位和表达；每张切片选取有代表性的区域，随机取5个互不重叠的400倍视野，以光密度200为背底，光镜显微照相机取图，应用Image-Pro Plus.v6.0图像分析系统进行定量分析，测量阳性目标累积光密度值（integrated optical density，IOD）,并用计算机进行统计学处理；⑥统计学处理：整理各类数据并应用SPSS 13.0软件对数据进行处理。
　　
　　2实验结果
　　2.1 皮瓣大体观察：术后7天，D组皮瓣近段颜色淡红，弹性好，并可见少量毛发生长；中段中间区颜色由近向远淡红色逐渐变暗，表面无痂壳形成，无毛发生长，边缘区颜色发黑并有少量痂壳覆盖，弹性减退；远段颜色发黑，表面有痂壳，弹性差。原位掀起皮瓣时见皮瓣出血活跃，出血量较多；肉膜下无积血积液，血管丰富。C组：皮瓣表面肉眼观与地塞米松组近似，皮肤弹性略好于地塞米松组，原位掀起皮瓣时可见肉膜下较薄一层淡红色新鲜肉芽组织，出血活跃，出血量较多，亦可见少量炎性渗出液。B组：皮瓣近段颜色淡红，弹性较好，少见毛发生长；中段颜色逐渐变暗，表面有部分黑色痂壳形成，无毛发生长，弹性较差；远段颜色发黑，痂壳较厚，弹性极差。原位掀起皮瓣时见肉膜下可见少量新鲜出血及少量渗出液。A组：皮瓣近段颜色淡红，由近向远颜色变暗，皮瓣蒂部可见少量毛发生长；中段及远段颜色发黑，表面有痂壳形成，弹性极差，原位掀起皮瓣时见皮瓣出血较少，肉膜下炎性分泌物较多，血管相对稀疏。根据观察结果，各实验组皮瓣中远段成活情况均明显好于A组；D组皮瓣中远段成活情况略好于C组和B组。
　　2.2 皮瓣成活率：术后7天皮瓣成活率，D组�C组�B组�A组，四组有非常显著性差异（F=32.08，P�0.01）。两两比较，B、C组间无显著性差异（P�0.05），其他各组间均有显著性差异（P�0.01）。（见表1）
　　2.3 HE染色光镜组织学观察
　　2.3.1 术后3天，D组：表皮及真皮各层结构无明显改变，皮下组织轻度水肿，血管扩张、充血，无明显嗜中性粒细胞浸润，成纤维细胞增生，肌纤维排列规则、紧密；C组：表皮及真皮细胞排列较规则，皮下组织水肿，血管扩张、充血明显，可见嗜中性粒细胞浸润，成纤维细胞大量增生，肌纤维排列较规则、结构紧密；B组：表皮及真皮细胞排列较规则，皮下组织水肿，血管扩张、充血，可见少量嗜中性粒细胞浸润， 肌纤维排列较规则、结构松散；A组：局限性表皮变薄，皮下组织水肿较重，血管扩张、充血，可见嗜中性粒细胞浸润，肌纤维排列紊乱、结构松散。术后7天，D组：表皮萎缩不明显，皮肤各层结构无明显改变，复层上皮细胞排列整齐；皮下组织轻度水肿，血管轻度扩张；可见散在的局灶性嗜中性粒细胞浸润；真皮和真皮下层新生小血管生长活跃，皮下纤维组织增生明显，纤维排列较规则。C组：局限性表皮萎缩、变薄、破溃；皮下组织水肿，血管扩张，有少许皮下出血；嗜中性粒细胞浸润明显；真皮和真皮下层可见新生小血管，皮下纤维组织增生，纤维排列较规则。B组：表皮破损，真皮层细胞排列较紊乱；皮下组织水肿，血管扩张，并有散在皮下出血；有明显的嗜中性粒细胞浸润；真皮和真皮下层可见少量新生小血管，肌组织松散，纤维排列较规则。A组：表皮及真皮完全坏死；结构混乱不清；大量的嗜中性粒细胞浸润；肌纤维坏死明显。
　　2.3.2 毛细血管计数：术后3天，D组（7.4±0.55）个�C组（6.8±1.09）个�B组（4.6±0.55）个�A组（3.2±0.84）个，四组有非常显著性差异（F=32.40，P�0.01）。两两比较，D、C组间无显著性差异（P�0.05），其他各组间均有显著性差异（P�0.01）。术后7天，D组（7.0±0.71）个�C组（3.8±1.09）个�B组（2.6±0.55）个�A组（0.4±0.55）个，四组有非常显著性差异（F=65.94，P�0.01）。两两比较各组间均有显著性差异，其中B、C组间比较P�0.05，其他各组间比较P�0.01。
　　2.3.3 成纤维细胞计数：术后3天，D组（27.8±3.56）个�C组（26.4±3.21）个�B组（11.8±2.86）个�A组（11.2±2.39）个，四组有非常显著性差异（F=44.18，P�0.01）。两两比较，D、C组成纤维细胞数量明显多于B、A组，差异显著（P�0.01）；D、C组间比较，B、A组间比较，均无显著性差异（P�0.05）。术后7天，D组（48.2±7.33）个� C组（23.6±4.45）个�B组（15.0±1.87）个�A组（0.6±0.89）个，四组有非常显著性差异（F=102.47，P�0.01）。且两两比较各组间有显著性差异（P�0.01）。
　　2.4 血清中TNF-α含量：术后0h、1h、4h、8h、12h、24h血清中TNF-α含量统计结果（图1）显示，A、C组于术后4h TNF-α的浓度达到高峰，然后逐渐下降，于术后24h下降明显；B、D组，于术后8h TNF-α的浓度达到高峰，亦于术后24h下降明显。各组峰值统计结果显示，B、D组明显低于A、C组，差异显著P�0.01。
　　2.5 ICAM-1在皮瓣中表达的免疫组织化学变化：术后4h，A、C组皮瓣组织的上皮细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞的胞浆中均呈现阳性表达,且表达量较多，呈散在性分布；B、D组在上皮细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞胞浆中的表达呈弱阳性，表达量很少，呈散在性局灶性分布。术后8h，各组均呈现ICAM-1阳性蛋白表达高峰，A、C组皮瓣上皮细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞的胞浆中呈强阳性表达，可见大量棕褐色阳性颗粒分布，B、D组阳性表达也明显增强，染色呈棕黄色，散在分布。术后12h，各组表达均有所下降，其中B、D组下降明显，但尚未恢复至术后4h水平，A、C组随较术后8h表达有所下降，但仍保持较高水平。术后4h、8h、12h测量 ICAM-1阳性目标累积光密度值统计结果（图2）显示，术后8h，各组均呈现ICAM-1阳性蛋白表达高峰，四组峰值有非常显著性差异（F=224.30，P�0.01），两两比较，A、C组明显高于B、D组（P�0.01）。
　　3讨论
　　皮瓣在缺血坏死过程中活化大量的中性粒细胞，活化过程中产生大量氧自由基，Ca2+超载，并分泌大量炎性细胞因子如：TNF-α、IL-1、IL-8等，造成内皮细胞破坏，中性粒细胞活化后还会经历与内皮细胞粘附，浸润到组织，中性粒细胞与内皮细胞的粘附可引起血管的持续性收缩，引起组织的低灌注，这也是造成缺血-再灌注损伤的原因，最终导致死亡。而粘附始于内皮细胞的细胞间粘附分子1（ICAM-1）与白细胞受体的结合。本研究免疫组化染色结果证实：应用地塞米松能够抑制上皮细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞胞浆中ICAM-1阳性蛋白的表达，有效的抑制了ICAM-1与白细胞受体的结合，从而减少中性粒细胞与内皮细胞的粘附，减轻皮瓣炎症反应。本实验中另一结果显示：地塞米松可以抑制中性粒细胞活化过程释放炎性细胞因子TNF-α，从而减轻皮瓣的炎症反应。术后即刻起手术应激导致血液中TNF-α浓度增高，随后逐渐增高，应用地塞米松可以延迟其峰值浓度出现时间，并有效降低其峰值，随后血清中TNF-α浓度下降，各组均于术后24h明显下降，且低于术后即刻水平。这提示我们临床应用地塞米松应愈早愈好，本实验进一步证实了地塞米松给药时间的选择应在TNF-α高峰出现前抑制其释放，即术后4h前尽早给药可以达到最佳效果。本实验于术后即刻一次性大剂量（5mg/kg）给予地塞米松腹腔注射可以有效减轻皮瓣炎症反应又避免了糖皮质激素副作用的发生。
　　缺血皮瓣与受床及伤口边缘组织间微循环重建直接影响缺血组织的存活。bFGF是一种广谱的有丝分裂原，具有广泛的细胞增殖效应。动物实验发现它能促进各种组织和器官内的血管再生，可显著增强内皮细胞粘附迁移、分裂增殖，促进血管新生，加速创伤愈合[1-3],也促进组织细胞本身的分裂增殖，诱导周围毛细血管向其内部的长入，尤其能促进内皮细胞分裂，这种作用可能通过上调VEGF (血管内皮生长因子)表达，诱导其分泌某些蛋白酸,溶解并侵入周围基质,进而形成毛细血管[4-6]。这种促血管生成作用有可能使皮瓣在移植后较早期与受体建立血管网。本实验结果也证实了bFGF有促进随意皮瓣成活的作用，光镜病理组织观察结果显示：应用bFGF组真皮及真皮下组织新生小血管生长活跃，皮下肌纤维组织增生明显，结构排列整齐。且联合应用地塞米松及bFGF组毛细血管数和成纤维细胞数均显著多于bFGF组（P�0.01），表明地塞米松能够增强bFGF的促血管内皮细胞和成纤维细胞生成作用。
　　本实验研究根据两种药物促进皮瓣成活机理不同，将地塞米松与bFGF两种
　　药物联合应用促进皮瓣成活的效果更佳。其发挥协同作用的机理仍有待进一步研究。
　　
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　　[收稿日期]2010-10-12 [修回日期]2010-12-21
　　编辑/张惠娟