无菌检查法

　无菌检查法

　1. 目的：建立对成品无菌检查的标准操作规程。

　2.范围：对成品的无菌检查。

　3.责任：质量监督部。

　4.内容：

　4.1 概述：无菌检查是检查药品与敷料是否染有活菌的一种方法。无菌检查的操作环境和全部过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，同时也应避免在有抑菌条件下操作。

　4.2 仪器、设备和用具：

　℃及除湿装置。缓冲间及操作室内均设置能达到空气消毒的紫外光灯和照明灯，操作室或工作台应保持空气正压。

　℃预培养 48 小时，证明无菌后将 3 个平板以无菌方式带入无菌操作间的洁净区域左、中、右各放 1 个；打开碟盖扣置，平板在空气中暴露 30 分钟后将盖盖好，置 35-37℃培养 48 小时，取出检查，3 个平板上生长的菌落数相加总数不得超过 10 个。

　无菌操作台面或超净工作台应定期请有关部门检测其洁净度，应达到 100 级（一般用尘埃粒子计数仪），检测尘埃粒径≤5μm 的粒数不得超过 3.5 个／升；空气流量应控

　制在 0.75-1.0m 3 /s；细菌菌落数平均<1 个，可根据无菌状况定期置换过滤器。

　℃的生化培养箱。

　4.2.3 离心机、显微镜、高压消毒炉、标准 pH 比色器（0.02酚红指示剂和溴钾酚蓝指示剂）、恒温烤箱。

　℃灭菌 30 分钟。

　4.2.4.1 移管、刻度吸管在管口上端内，松松地塞入少许棉花，然后放于吸管筒内或牛皮纸袋内，盖严，消毒备用。

　±0.5）℃蒸气灭菌 30 分钟，物品取出时切勿立即置冷处，以免急速冷却，使灭菌物品内蒸气冷凝造成负压，易致染菌，应置恒温培养箱中烘干。适于高温灭菌的器皿也可采用 160℃干热灭菌 2 小时。

　4.3 试液：

　4.3.175％乙醇溶液配制酒精棉球用。

　4.3.2 碘酊溶液配制碘酒棉球用。

　4.3.3 灭菌生理盐水 0.9％氯化钠溶液，分装于试管或三角瓶中，瓶口用棉塞或海棉胶专用塞塞紧并用牛皮纸包扎，灭菌备用。

　4.3.4 新洁尔尔灭（1:1000）溶液。

　4.3.53-5％甲酚溶液。

　4.3.60.02％酚红指示剂 pH6.8-8.4 系列比色液管。

　4.3.7 溴钾酚蓝指示剂 pH6.0-7.6 系列比色液管。

　4.3.82mol／L 盐酸溶液。

　4.3.92mol／L 氢氧化钠溶液。

　4.4 培养基：

　4.4.2.1 除葡萄糖和指示剂外，将处方中各成分加水后置有石棉网的电炉或适宜的加热设备中，使微温溶解。用2mol/L 盐酸溶液或 2mol／L 氢氧化钠溶液调节 pH 值，使其比规定的 pH 值略高 0.4-0.6，煮沸，用棉（纸）浆减压抽滤或以脱脂棉、滤纸等滤材过滤，使培养基澄清。

　4.4.2.2 加入葡萄糖和指示剂溶液，摇匀，补足水量，调节pH 值（比规定的 pH 值略高 0.2-0.4），使灭菌后为 7.1±0.2，分装，装量不宜超过容器的 2／3，以免灭菌时溢出。

　4.4.3 培养基灵敏度检查：新购的干燥培养基或采用不同牌号原材料的新鲜培养基，其质量均应符合灵敏度检查要求。

　A 需气菌、厌气菌培养基，用藤黄微球菌和生孢梭菌两种菌检查。

　取藤黄微球菌[MicrococcuIuteaCMCC（B）28001］的新鲜斜面培养物，加灭菌生理盐水约 3ml，制成均匀的菌悬液，然后以 10 倍系列稀释后并计数，将该菌稀释成

　1:10 5 -1:10 8 的系列浓度管。

　取生孢梭菌[ClostridiumsporogonesCMCC（B）64941]的需气、厌气培养基的新鲜培养物，用灭菌毛细管将其吸至灭菌离心管内，离心，弃去上清液，沉淀菌体用灭菌生理盐水制成均匀菌悬液，照上述方法进行稀释并计数，将该菌稀释成 1:10 6 一 1:10 9 系列浓度管。

　B 霉菌培养基用白色念珠菌检查 取白色念珠菌[CandidaalbicansCMCC（F）98001］霉菌琼脂培养基斜面的新鲜培养物，接种至霉菌培养基内，20-25℃培养 24 小时。照藤黄微球菌项下方法稀释及计数。将该菌稀释成 1:10 5 -1:10 8 系列浓度管。

　C 将上述制备的各菌的系列浓度管各 1ml，分别接种于 9ml试验培养基中，每个稀释浓度至少接种 3 管，以未接种的培养基管对照，细菌试验管置 30-35℃培养 3 天，白色念珠菌试验管置 20-25℃培养 5 天，逐日记录结果。

　D结果判断以接种后培养基管数的2／3以上呈现生长的最高稀释度为该培养基的灵敏度（且接种量均应小于 10 个菌落），3 次试验中，以两次达到的最高灵敏度为判断标准。

　需气菌、厌气菌培养基灵敏度藤黄微球菌 1:10 6 ,生孢梭菌

　1:10 7 ，霉菌培养基灵敏度为白色念珠菌 1:10 6 。

　4.4.4 配制的培养基应在凉暗处保存，一般不得超过 2 周，临用前细菌和霉菌培养基分别经30-35℃和20-25℃培养不少于 48 小时和 72 小时，证明无菌生长后方可使用。

　4.5 对照用菌液的制备：

　“抗生素微生物检定法”标准操作规程项下操作。

　aureusCMCC（B）26003]的营养琼脂斜面新鲜培养物少许，接种至相同培养基内，在 30-35℃培养 16-18 小时，用灭菌生理盐水稀释成 1:10 6

　sporogonesCMCC（B）64941]的需气菌、厌气菌培养基新鲜培养物少许，接种至相同培养基内，在30-35℃培养18-24小时，用灭菌生理盐水稀释成 1:10 6 。

　CMCC（F）98001]的霉菌琼脂培养基斜面培养物少许，接种至霉菌培养基内，在 20-25℃培养 24 小时，用灭菌生理盐水稀释成 1:10 5 。

　4.6 检查法的操作：

　4.6.1 供试品、培养基在移入缓冲间之前应先编号，并用0.1％新洁尔灭或酒精棉擦拭瓶（管）外壁，然后连同其它用具（包括无菌衣、帽、口罩等）移入缓冲间，打开无菌间紫外光灯和空气过滤装置开关并使其工作在 1 小时以上。

　粉针剂、油剂等橡皮塞铝盖压封小瓶先用 75％酒精棉球擦拭外壁及瓶塞，待干，用消毒镊子剔去铝盖上的铝质小圆片。用碘酒棉球拭抹瓶盖及橡皮塞，再用 75％酒精棉球擦去碘酒，并将酒精棉球盖于橡皮塞上待取样。

　供试品溶液的每管接种量与培养基分装量 供试品装量（ml）每管接种量（ml）培养基分装量（ml）

　2ml 或 2ml 以下 0.510 接种后轻轻摇动，使匀，需气菌、厌氧菌培养基在 30-35℃培养 5 日，霉菌培养基在 20-25℃培养 7 日，培养期间应逐日检查是否有菌生长（阳性对照在 24 小时内应有细菌生长），并填写无菌检查记录表。如在加入供试品溶液后培养基出现浑浊或沉淀，经培养后不能从外观上判断时，可取该培养液种入另 1 支相同的培养基中或斜面培养基上，培养 48-72 小时后，观察是否再现浑浊或在斜面上有无菌落生长，并在接种的同时，取培养液少量，涂片制成染色标本，用显微镜观察是否有菌生长。

　4.7 结果判断：当阳性对照管显浑浊并确有细菌生长时，可根据观察所得的结果判定，如需气菌、厌气菌及霉菌培养管均为澄清或虽显浑浊但经证明并非有菌生长，均应判为供试品合格；如需气菌、厌气菌及霉菌培养管中任

　何管显混浊并确证为有菌生长，应重新取样，分别依法复试 2 次，除阳性对照管外，其他各管均不得有菌生长，否则应判为供试品不合格。