检测口蹄疫病毒抗原方法

　 检测口蹄疫病毒抗原的方法

　（一）口蹄疫反向被动红细胞凝集试验（反向被动血凝）

　 红细胞膜具有吸附抗原或抗体的特性，将提纯的口蹄疫抗体（IgG）在pH4.0醋酸缓冲液中致敏绵羊红细胞，当这种被致敏的红细胞（即红细胞表面均带有口蹄疫抗体），遇到相应的口蹄疫病毒抗原时，便产生抗原抗体的特异性反应，从而使红细胞发生肉眼可见的凝集现象。该法快速、简便、准确、可同步鉴定出口蹄疫毒型和鉴别口蹄疫、猪水泡病病原。

　 1．试验材料

　V型96孔130o血凝滴定板、玻璃吸管（1毫升、5毫升毫米毫米sia-I 型、SVD（猪水泡病）反向被动血凝诊断试剂及其配套用的口蹄疫各型、猪水泡病阳性抗原、阴性抗原、稀释液、待检抗原。

　２．试验方法

　（１）稀释待检抗原 取中试管8支，横列于试管架上，每管各加入稀释液1 毫升毫升毫升毫升sia-1型4支、SVD4支）。每种阳抗第1管，加稀释液4.7毫升~4管各加稀释液0.5毫升0.1毫升(100微升)0.5毫升毫升0.5毫升~5排的第8孔，每孔50微升~5排的第7孔，取第6管待检抗原（1：192）加入1~5排的第6孔……直至第1孔，每孔均为50微升~5排的第10孔加入1：40的阴性抗原，每孔50微升sia-1型和SVD1：384稀释度的阳性抗原，每孔50微升Asia –1型抗原；第5排的11孔加SVD抗原）。1-5排的第12孔各加稀释液50微升~8孔和10~12孔加O型诊断液，每孔25微升~8孔和10~12孔加入A型诊断液，每孔25微升~8孔和10~12孔加入C型诊断液，每孔25微升~8孔和10~12孔加入Asia-1型诊断液，每孔25微升~8孔和10~12孔加入SVD诊断液，每孔25微升秒~5排的10~12孔，每排的第10孔为阴性抗原对照孔，应无凝集现象，红细胞应全部沉入孔底，形成边缘整齐的小圆点；每排的11孔为阳性抗原对照孔，应出现“++” ~“#”的凝集现象（即有50~100%红细胞发生凝集，红细胞悬于孔中，不沉入孔底），证明所加的反向诊断液效价不低于1：384，用于检测抗原合格；每排的第12孔为稀释液对照孔，也应无凝集现象，红细胞应全部沉入孔底，形成小圆点。

　在上述对照孔判定合格的前提下，仔细观察血凝板上的1~5排的1~8孔，某排1~8孔或1~6孔均有“++” ~“#”凝集现象，而其余4排仅在1~2孔出现“+” ~ “++”的凝集，即可判定该份待检抗原为阳性。其型别与所加的反向诊断液的型别相同。比如第1排1~8孔出现“++”以上的红细胞凝集，第2~5排无此现象，便可判定该待检抗原为O型口蹄疫。

　以出现“++”以上凝集的待检抗原最大稀释度为其抗原滴度。例如第1排的1~4孔出现“#”凝集，第5孔出现“+++”凝集第6孔出现“++”凝集，第7孔出现“+”凝集，第8孔无凝集现象，即判定该待检抗原为O型，滴度为1：192（以第6孔出现“++”凝集为滴度的终点）。

　４．注意事项

　（１）勿用90o和110 o血凝板，防止误判。

　 （２）阴性抗原、阳性抗原和稀释液3孔对照全部或部分出现不合格时，检测结果不能判定，应更换试剂重新检测，以免错判。

　（３）严重腐败变质的病料不宜检测，以防非特异反应。

　（４）病料太少，无法检测时，可制成1：10或1：20悬液，先接种3~5日龄小白鼠，连传3代后，用鼠组织制成待检抗原，再进行检测。

　（５）检测过程中，有时出现前带现象，即第1孔或第2孔的红细胞沉淀形成小园点，第3孔以后又出现“++”以上的凝集，这是因为抗原抗体比例失调所致，不影响结果判定。

　 反向被动红细胞凝集试验的诊断液及其配套试剂由中国农科院兰州兽医研究所供应。

　（二）口蹄疫微量补体结合试验

　 补体的作用是无特异性的，它能与任何一组抗原抗体复合物结合并不再游离。但不能单独与抗原或抗体结合。当抗原与其相应的抗体结合成复合物之后，可与补体结合，但这种反应不能用肉眼观察。如果抗原是红细胞与其相应抗体（溶血素）形成复合物后，当有补体存在时，红细胞就发生溶血；如补体已被其他抗原抗体复合物结合，则不溶血。这种现象用肉眼是可以观察到的。因此利用溶血反应作为指示剂，以检验补体是否已被前一种抗原抗体系统所结合，这种试验叫做补体结合试验。前者称为溶菌系统或试验系统，后者称为溶血系统。如果溶菌系统的抗原抗体是相应的，则补体被结合，加入溶血系统后不发生溶血。反之，二者不对应，则补体游离，加入溶血系统后发生溶血。所以在补体结合试验中，溶血判为阴性；不溶血则判为阳性。

　操作步骤如下：

　１．测定溶血素效价

　 （1）取试管10支列于管架上，1~10管内各加生理盐水0.5毫升0.2毫升9.8毫升=1:100 毫升毫升0.5毫升 0.5毫升0.5毫升毫升~8管的溶血素稀释度依次为1：1 000~1：8 000，第9、10管为对照管。

　 （5）将补体（豚鼠血清）用生理盐水稀释成1：10，1~9管各加0.5毫升0.5毫升~10管各加0.5毫升毫升 10 生理盐水 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

　1：500溶血素 0.5 补体（1：10） 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5(1:500溶血素) 红细胞（2%） 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 37℃20分钟

　 — — — — + ++ +++ ＃ ＃ ＃ 按此表滴度结果，该溶血素效价＝1：4 000，工作浓度为效价的4倍即1：1 000。

　测定补体效价

　溶血素效价被测出后，即可滴定补体效价。新鲜补体或冻干补体被稀释后，容易失效，宜用10% NaCl保存，即补体1份十10%Nacl 1份，混合后置4℃或-20℃贮存有效期2~3个月。

　取保存补体2毫升毫升.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 补体（1：10） 0.45 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 溶血素（工 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

　作浓度） 红细胞（2%） 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 37℃30分钟

　 — — — + ++ +++ ＃ ＃ 以出现完全溶血的补体最大稀释度为其效价。

　按此表测出的该补体效价为0.35，工作浓度为0.45。

　以上A和B两步骤称为预备试验，溶血素一般半年滴定一次。而补体则必须在每次试验前滴定，如果补体效价不准确，将会影响试验的结果。

　 3．将标准血清（已知阳性血清）用生理盐水稀释成1：4（阴性血清1毫升毫升~5排的1~7孔，各滴2滴（约50微升~5排的1~4孔，每孔1滴（约25微升~5排的第6孔依次分别滴入O、A、C、Asia-I 型和SVD阳性抗原1滴，1~5排的第7孔各滴入盐水1滴,作为阴性、阳性和盐水对照。

　1~5排的1~4孔依次分别加入O、A、C、Asia-I 型和SVD标准清1滴（25微升~5排的1~7孔各加补体工作浓度2滴（50微升~5排的第1~4孔中任一孔呈现不溶血则判该份待检抗原为阳性，其型别与所加标准血清的型别相同。

　该法操作较繁琐，敏感性低，但特异强。

　（三）口蹄疫酶联免疫吸附试验（ELISA）

　八十年代以来，国外常采用ELISA鉴定口蹄疫和猪水泡病病毒。国内也有人试用该法对FMDV 和SDV进行检测，由于IgG的纯度不高，经常出现非特异性反应。影响检测的准确性，使推广应用受到限制。

　ELISA技术虽然多种多样，但一般以双抗体夹心法居多。用最适浓度抗口蹄疫血清的IgG包被酶标板孔4℃过夜，经洗涤后加入待检抗原37℃保温1小时，洗涤后再加辣根过氧化物酶标记的兔抗豚鼠血清的IgG 37℃保温1小时，洗涤后加底物溶液（邻苯二胺和H2O2），30分钟后用2M H2SO4中止反应，751型分光光度计492nm测定光密值或在酶标检测仪上直接测定。阳性OD值为0.7~0.9；阴性OD值为0.1~0.3。

　（四）免疫荧光直接检检测口蹄疫带毒肉品的操作方法

　 1．试验材料

　 （1）荧光显微镜及自动照相装置 1台

　 （2）冰冻组织切片机 1台

　 （3）电热恒温箱 1台

　 （4）玻璃染色缸 2具

　 （5）玻璃片 5盒

　 （6）组织切片盒 2个

　 （7）抗体（O型、A型、Asia-I型、SVD等4种）

　 （）0.01MpH~7.4的PBS

　 （9） 丙酮

　 （10） 伊文斯兰（万分之二浓度）

　 2．操作方法

　 （）.5~2cm ,宽0.8~1cm 厚 0.3~0.5cm的组织块。

　 （2）在冷冻组织切片机上，低温切成5~6微米 （3） 冷丙酮固定（室温下20分钟或在4℃下30分钟）。

　 （）0.01MpH7.2~7.4 PBS漂洗3次，每次1分钟，用滤纸吸去样品周围水份，切勿碰损样品，再用吹风机吹干样品。

　 （） （） （） （） （）~3个绿色荧光点为“++”；视野中仅见1~2个绿色荧光点为“+”，未见任何荧光点则为“—”。

　 （） （1）根据本地及邻近地区的疫情，认为有必要时，每份样品应切片8张，每种荧光抗体染色2张切片进行观察。无必要时，每份样品只切2张，用O型荧光抗体染色亦可。

　 （）~2份阴性淋巴结在相同条件下切片染色和观察，以作阴性对照。

　 （） （）~5日小白鼠盲传2~3代，每代72小时扑杀，注意观察症状，最后反向间接血凝诊断液复检判定。

　 （）（）