涎腺基底细胞腺癌 人小涎腺成纤维样单克隆细胞的成骨分化

　　[摘要]目的:探索人小涎腺成纤维样单克隆细胞的体外培养、扩增方法,鉴定其性质,研究向成骨细胞分化的潜能。方法:组织块贴壁法原代培养人小涎腺细胞,收集成纤维样细胞,用96孔板稀释铺板法克隆培养,免疫荧光和RT-PCR检测细胞表型,并进行成骨诱导分化,通过骨钙素、一型胶原免疫细胞化学染色及碱性磷酸酶、茜素红钙结节染色鉴定成骨分化。结果:成功的在体外扩增培养出人小涎腺成纤维样单克隆细胞,免疫荧光证实细胞表达CD13、CD29、CD106和CD44,RT-PCR显示CK18、α-SMA、vimentin、CD106、nestin基因表达与人骨髓间充质干细胞相似。成骨诱导8天后,碱性磷酸酶表达阳性率100%,19天后骨钙素和一型胶原大量表达,并形成钙结节。结论:所建立的分离培养体系能够获得大量人小涎腺成纤维样单克隆细胞,免疫表型类似于间充质干细胞。在成骨诱导培养条件下具有良好的向成骨细胞分化的潜能。
　　[关键词]小涎腺;单克隆培养;成骨诱导;组织工程骨
　　[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455(2010)04-0523-04
　　
　　Osteogenic differentiation of human small salivary gland fibroblast-like monoclonal cells
　　DU Ming-juan, ZHAO Zhen-min, YAN Li, YIN Ning-bei, SONG Tao, LI Hai-dong
　　(Plastic Surgery Hospital, Peking Union Medical College, Chinese Academy of Medical Sciences, Peking 100144, China)
　　
　　Abstract:ObjectiveExplore the method of culturing and proliferating human small salivary gland fibroblast-like monoclonal cells in vitro, identify the character of the cells and study the potential of osteoblast differentiation.MethodsHuman small salivary gland cells was primary cultured using tissue adherent method, we collect the fibroblast-like cells and clonal culture them using 96-well plates dilution decking method, and detect cell phenotype by immunofluorescence and RT-PCR. Then we start osteogenic inducing, and identify osteogenic differentiation through osteocalcin, collagen typeⅠimmunocytochemistry staining and alkaline phosphatase(AKP), alizarin red staining.ResultsWe successfully amplify human small salivary gland fibroblast-like monoclonal cells in vitro, these cells express CD13, CD29, CD106 and CD44 proved by immunofluorescence, and express gene CK18, α-SMA, vimentin, CD106, nestin revealed by RT-PCR similar to human bone marrow-derived mesenchymal stem cells. After 8 days of osteogenic differentiation, the positive expression rate of AKP is 100%, after 19 days the expressive number of osteocalcin and collagen typeⅠis large, and there are many calcium nodules formation.ConclusionWe can harvest a large number of human small gland fibroblast-like monoclonal cells through the isolation and culture system that we built, their immune phenotype is similar to mesenchymal stem cells, and they have good osteogenic potential in osteogenic induction culture conditions.
　　Key words: small salivary gland; monoclonal culture; osteogenic induction; bone tissue engineering
　　
　　组织工程和干细胞治疗为骨缺损等骨组织疾病的治疗带来新的希望。种子细胞的来源是根本问题,目前多数研究主要是以骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞为种子细胞。近年来,已有文献报道人的腮腺存在间充质干细胞[1],小涎腺与其组织结构和细胞成分类似,可能同样含有此种干细胞,而且小涎腺广泛分布于口腔粘膜下,取材方便,来源丰富。本实验用单克隆培养技术成功扩增培养人小涎腺成纤维样单克隆细胞,免疫表型类似间充质干细胞,并证实其具有良好的成骨分化潜能,可能成为新的种子细胞。
　　
　　1材料和方法
　　1.1 材料:小涎腺来源于临床上3例唇腭裂患者(术中暴露于上唇粘膜切口的需要去除的小涎腺),年龄分别为3个月、 6岁和21岁,患者无腺体相关疾病和自身免疫性疾病史。
　　1.2 主要试剂:DMEM-F12、DMEM(LG)(Hyclone),胎牛血清(Gibico),0.25%胰蛋白酶、青/链霉素、牛胰岛素、地塞米松、铁传递蛋白、维生素C、β-甘油磷酸钠均购于Sigma公司,Hu EGF和HGF购于PeproTech公司,即用型SABC免疫组化染色试剂盒、即用型Cy3/FITC免疫荧光染色试剂盒和兔抗人CD29、CD13、CD106、CD44抗体购自博士德,茜素红粉剂(优博奥),BM Purple(Roche),兔抗人一型胶原和骨钙素(博奥森),TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0(北京六合通)。
　　1.3 原代培养:取唇裂患者术中暴露于上唇粘膜切口内需要切除废弃的含小涎腺的组织,去除多余的结缔组织,分离得到完整的小涎腺,滴少量培养基以保持组织块湿润,用眼科剪将其剪成大约1mm3的碎块,均匀的铺于培养瓶底部,间距平均5mm,加好培养基后竖立放于培养箱中,4h后放倒使组织块完全浸在培养液中,4天后首次观察换液,以后每3天换一次液。原代培养10～14天。
　　培养基为完全培养基:DMEM-F12 1:1,10%胎牛血清,1%青/链霉素。
　　1.4 克隆培养方法(96孔板稀释铺板法):组织块贴壁法长出的原代细胞用0.25%胰酶37°C消化1min,获得成纤维样细胞,计数,稀释至10个细胞/ml,以100μl/孔接种于96孔板,过夜贴壁后,镜下观察,挑选出只有1个细胞的孔,待细胞80%融合后依次传代至24孔培养板,6孔培养板和25cm2培养瓶。
　　克隆培养基: DMEM/F12 1:1,10%胎牛血清,牛胰岛素5μg/ml,地塞米松 10-7mol/L,铁传递蛋白5μg/ml,Hu EGF 20ng/ml,HGF 50ng/ml。
　　1.5 鉴定克隆细胞:每例患者随机选取三个克隆,分别用CD13、CD29、CD44、CD106抗体进行免疫荧光染色,检测克隆细胞的免疫表型。
　　分别提取上述9组单克隆细胞的RNA,测定样品在260nm的吸收值确定RNA的纯度和浓度。RT-PCR检测CK18、α-SMA、vimentin、CD106、nestin基因在人小涎腺成纤维样克隆细胞与骨髓间充质干细胞中的表达,比较差异。RT-PCR使用TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0。
　　实验步骤均按试剂盒说明书操作。检测基因的引物、大小和退火温度见表1。
　　1.6 成骨诱导分化及鉴定:成骨诱导:将克隆细胞接种于预置玻片的35mm培养皿,待长到70%～80%融合时换成骨诱导培养基,每3天换液一次。成骨诱导培养基:DMEM(LG),10%胎牛血清,1%青/链霉素,0.1μM地塞米松,维生素C50μM,β-甘油磷酸钠10mM。
　　分别在诱导的第0、8、19天固定预置的细胞爬片,4%多聚甲醛固定30min,①碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,AKP)染色,使用BM-purple染液,观察阳性细胞比例;②Dah1 McGec-Russell氏茜素红染色,观察能否及何时形成钙结节;③一型胶原和骨钙素SABC免疫细胞化学染色,DAB显色。
　　1.7 阴性对照:所有培养步骤相同,但用完全培养基代替成骨诱导液。
　　
　　2结果
　　2.1 细胞生长增殖情况:分离得到的小涎腺,成人约一到两个可接种于一个25cm2培养瓶,儿童和婴儿约需要三个。接种后4～5天开始有细胞爬出,有的为上皮样,也有的为成纤维样。经过原代培养10～14天左右传第一代,0.25%胰酶37℃消化1min,成纤维样的细胞基本全部消掉,而上皮样细胞很难消掉。本实验研究对象即为成纤维样的细胞。
　　每例患者原代细胞接种于1个96孔板,三例获得单个细胞孔分别为6、7、8个,最终共获得13个克隆。用克隆培养基培养的单克隆细胞一直保持原有的细胞形态,多呈细长的成纤维细胞样,但不同克隆间存在微小差异,有的相对短小。
　　细胞增殖能力强,从96孔板1个细胞扩增到25cm2培养瓶3.9×105～1.1×106个细胞,平均需要21.6天时间,倍增了18～20次。
　　2.2 克隆细胞免疫表型类似于间充质干细胞:不同克隆的免疫荧光染色证实克隆细胞均表达CD29、CD13、CD44这些公认的间充质干细胞标记,虽然不同克隆表达CD106荧光强弱不一,但均为阳性,见图1。
　　RT-PCR结果显示人小涎腺成纤维样克隆细胞表达CK18、α-SMA、vimentin、CD106、nestin基因与骨髓间充质干细胞类似,见图2。
　　2.3 成骨分化:形态学改变:换成骨诱导液后,皿内细胞体积变大,形态为多边形,核仁清晰,细胞内颗粒增多,随时间延长有些形成小球样结构,有些呈克隆样,中间隆起形成立体结构。
　　通过碱性磷酸酶、骨钙素、一型胶原和钙结节的表达情况来鉴定成骨分化。
　　2.3.1 碱性磷酸酶染色:诱导第0天,有少量的碱性磷酸酶染色阳性细胞,随后其表达逐渐增多,到第8天,所有细胞均为阳性,至第19天表达量仍继续增加。阳性表现为细胞内外的蓝色颗粒,见图3(AKP 0、8、19天)。
　　2.3.2 骨钙素和一型胶原免疫细胞化学检测:诱导的第0天,二者均没有表达,第8天仅有少量骨钙素表达,至第19天,两者均大量表达,尤其在细胞克隆样生长的中央,结节样,呈棕黄色,见图4(骨钙素0、8、19天),图5(一型胶原8、19天)。
　　2.3.3茜素红染色:钙结节出现在诱导两周以后,呈鲜艳红色,见图6。
　　2.4 阴性对照:对照组有碱性磷酸酶的部分表达,第19天有少量的骨钙素表达阳性细胞,其他标记物阴性。
　　
　　3讨论
　　种子细胞是组织工程的关键环节之一。骨组织工程理想的种子细胞来源应具备下列特点:①取材容易,对机体的损伤小;②在体外培养中易定向分化为成骨细胞和具有较强的传代繁殖能力;③植入机体后能适应受区的环境并保持成骨活性[2]。当前成骨细胞主要来源于骨、骨外膜、骨髓和骨外组织。骨与骨膜来源的种子细胞在体外较易定向分化为成骨细胞, 培养也较容易, 但取材困难, 每次获取均会造成新的创伤,获得的细胞数量也有限。骨髓来源虽然相对充足、取材方便、成骨能力确切,但其本身数量有限,并且随年龄增长骨髓基质细胞会不断减少。
　　骨外来源的种子细胞成为新的研究热点。已有文献报道人的腮腺存在成纤维样的间充质干细胞,能够在体外诱导分化为成骨、脂肪和软骨细胞[1]。小涎腺与大唾液腺组织结构和细胞成分类似,可能同样含有此种干细胞,具有分化为成骨细胞的潜能。小涎腺相对于其他种子细胞其资源丰富,广泛分布于口腔粘膜下;取材方便,位置表浅仅需局麻;创伤微小,不留瘢痕。
　　我们建立的培养体系能够从很少量的小涎腺中分离培养出大量成纤维样的单克隆细胞,细胞系得到纯化,得到的细胞增殖能强,经过长时间培养和多次传代后细胞仍保持良好的状态和增殖活性,可大量扩增。
　　CD29、CD13、CD44已被公认为人间充质干细胞标记[3],CD106在人骨髓间充质干细胞阳性表达[4]。小涎腺成纤维样克隆细胞均表达这些标志物并与骨髓间充质干细胞的CD106、α-SMA[4]、vimentin[5]、nestin[6]、CK18[7]基因表达相似。这些都说明其免疫表型与间充质干细胞类似。
　　本试验用简单的化学诱导方法,即体外培养时加入适量地塞米松、维生素C和β-甘油磷酸钠这些成骨添加剂[8],即可使克隆细胞向成骨细胞分化。成骨诱导开始后碱性磷酸酶表达迅速增加,至第8天全部细胞均为阳性,随后仍继续增加。碱性磷酸酶是一类与矿物质形成紧密相关的蛋白质,钙离子在其作用下,沉积于胶原上,完成基质矿化过程,是成骨细胞成熟的重要标志[9]。至诱导第19天,细胞克隆样生长的中心形成很多茜素红染色阳性的钙结节,这些结节也表达骨钙素和一型胶原。钙结节和骨钙素是成骨细胞的特征性标志。上述表现可证明克隆细胞在体外诱导培养中易向成骨细胞分化。此外,未诱导的细胞也有部分表达碱性磷酸酶,而且在第19天有少量细胞BGP表达阳性,说明这种细胞有向成骨细胞分化的倾向。
　　综上所述,小涎腺成纤维样克隆细胞有潜力成为骨组织工程新的种子细胞,为进一步的研究打下基础。
　　
　　[参考文献]
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　　[收稿日期]2010-01-26[修回日期]2010-03-26
　　编辑/张惠娟