黄芩苷和川芎对ＵＶＢ辐射皮肤成纤维细胞的影响_重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶

　　[摘要]目的：研究中药活性成分黄芩苷，川芎对中波紫外线(UVB)辐射损伤成纤维细胞保护作用的影响及相关作用机制。方法：采用0mJ/cm2，30mJ/cm2，60mJ/cm2，90mJ/cm2剂量UVB照射培养的原代人皮肤成纤维细胞，同时加入黄芩苷和川芎干预处理，观察细胞损伤的形态学变化，以MTT法检测细胞活性，以酶联免疫吸附实验(ELISA)检测IL－10，IL－12和TNF－a的分泌量。结果：UVB照射后，细胞损伤程度与照射剂量呈正相关，增殖活性下降；此外，UVB照射后IL－10等细胞因子分泌增加，而加入所试中药干预可明显抑制细胞损伤和相关细胞因子分泌。结论：黄芩苷、川芎有一定的光保护作用，抑制炎症细胞因子IL－10，IL－12，TNF－a的分泌可能是其减轻UVB光损伤的机制之一。
　　[关键词]紫外线；成纤维细胞；黄芩苷；川芎；IL－10；IL－12；TNF－a；光损伤；光保护
　　[中图分类号]Q256　[文献标识码]A　[文章编号]　1008－6455(2007)07－0977－03
　　
　　紫外线的辐射(包括UVA，UVB)是导致人体皮肤日晒伤、光老化及皮肤癌的主要因素。高紫外线暴露人群皮肤老化危险性比低暴露人群高一倍，老化发生提前10年。皮肤光老化不仅有损于人的美容，而且与皮肤病的发生有着病因学的联系。中波紫外线(UVB)辐射可引起皮肤老化的发生，外观出现干燥，粗糙，失去弹性，产生皱纹，皮肤的弹性蛋门和胶原蛋白的含量出现变化。成纤维细胞是UVB敏感的靶细胞，经UVB辐射后，可以释放一些具有免疫调节作用的细胞因子，引发一系列的信号传导，最终可以导致皮肤老化的发生。
　　IL－10，IL－12，TNF－a均是由皮肤成纤维细胞合成的土要细胞因子，参与紫外线引起的皮肤炎症反应过程及免疫调节，并在紫外线介导的细胞凋亡中起着重要作用。传统中药黄芩中的活性成分黄芩苷，及川芎等可抑制紫外线照射所致的皮肤脂质过氧化，防治皮肤的光损伤。本文通过体外培养人原代表皮成纤维细胞，用一定剂量的UVB照射，并分别以所选中药处理，旨在证实所选药物可缓解UVB照射的损伤作用。
　　
　　1　材料和方法
　　
　　1．1　材料：健康青少年男性包皮环切术切除的包皮，生理盐水，0.5％的中性蛋白酶(sigma公司)，表皮消化液(0.25％的胰蛋白酶和0.1％的EDTA，Amresco公司)，DS培养基(DMEM加10％小牛血清，GIBCO公司)，四甲基偶氮唑(sigma公司)，黄芩苷(中国药品检验所)，川芎(中国药品检验所)，96孔培养板。
　　
　　1．2　方法
　　1．2．1　原生代成纤维细胞培养：将包皮剪成0.5cm×0.5cm的皮片，碘伏浸泡5min后用含青霉素(10万u/L)和链霉素(100mg/L)的生理盐水漂洗3次，加入0.5％中性蛋白酶，在4℃下消化18－20h，将皮片的真、表皮进行分离，真皮部分以表皮消化液在37℃下消化5min后，加入DS培养基，轻轻吹打，200目尼龙网过虑，过滤后的细胞液1500r/min离心5min，弃去上清，加入DS培养基继续培养。
　　以0.25％胰酶和0.02％EDTA消化上述细胞，调整其密度为1×106/ml定量接种于96孔板，培养24h，待其贴壁后用于细胞活性检测和细胞因子水平检测。
　　1．2．2　实验分组：实验分为量效组和加药组，每组均设OmJ/cm2为对照组，量效组接受30mJ/cm2，60mJ/cm2，90mJ/cm2UVB照射后孵育24h，加药组加入黄芩苷、川芎预处理后，接受30mJ/cm2，60mJ/cm2及90mJ/cm2 UVB辐射孵育24h，根据预试验结果选用黄芩苷浓度为15μg/ml，川芎浓度为50μg/ml。
　　1．2．3　紫外线照射：接种于培养板中的细胞生长至70％融合时给予UVB照射，照射前先弃去各孔细胞培养液，PBS洗二遍后加少量PBS覆盖底面，置紫外线辐射仪(上海sigma技术有限公司生产，发射峰310nm)照射，细胞与灯管距离15cm，然后弃覆盖液换回DMEM培养基。
　　1．2．4　四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖活性：照射细胞后24h向每100μl培养基中加入20μl浓度为5mg/ml的MTT，孵育4h后弃上清，加入120μl二甲基亚砜(DMSO)，室温震荡15min，用128c酶标仪(奥地利CliniBio公司)在570nm波长处测吸光度OD值，空白试剂孔调零，读取吸光度值。
　　1．2．5　酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞因子分泌量：上述细胞照射后24h收集细胞培养上清液，冻存于－70℃冰箱。使用ELISA试剂盒(BPBBiomedical，Inc)严格按说明书操作。简要步骤：离心检测标本取上清和标准品一起加入相应孔中，(每个标本设3个复孔)，加入生物素化抗体工作液孵育45min，洗板后加入酶标记液孵育45min，洗板后加入底物孵育15min，然后加入终止液，混匀即用酶标仪测OD450值。
　　1．2．6　统计方法：以spss11.0统计软件对实验数据进行单因素方差分析，当P＜0.05时认为差异有统计学意义。
　　
　　2　结果
　　
　　2．1　UVB对成纤维细胞光损伤的形态学影响：成纤维细胞在接受不同计量(3OmJ/cm2，60mJ/cm2，90mJ/cm2)UVB照射后24小时，细胞均受到不同程度的损伤，表现为细胞肿胀、细胞碎片增多且部分漂浮于培养液中。以90mJ/cm2 UVB损伤作用最强，60mJ/cm2的损伤作用次之，30mJ/cm2则较弱。
　　
　　2．2　UVB对细胞增殖活性的影响：量效组在接受照光后24小时检测细胞活性，差异有统计学意义(P＜0.05)。加药组中，OmJ/cm2组24h细胞活性检测与对照组无明显差异，表明所加药物在该浓度对细胞活性无明显影响。不同剂量UVB照射24h细胞活性下降，其下降幅度与UVB照射剂量相关，有显著性差异。UVB加药组处理的细胞活性均较UVB单纯照射组有所恢复，其中在低剂量照射组恢复程度高于高剂量组照射组的恢复程度(表1)。
　　
　　2．3　受试药物及UVB对细胞因子分泌水平的影响：随着UVB辐射剂量的增加(OJ/cm2、30J/cm2)、 60J/cm2、90mJ/cm2)，成纤维细胞分泌IL－10，IL－12及TNF－a的量也逐渐增多。加入工具药物干预后，黄芩苷和川芎在每个UVB剂量水甲均可抑制上述细胞因子的分泌(P＜0.05)(表2)：


　　
　　3　讨论
　　
　　来自日光的紫外线对皮肤晒伤、皮肤炎症、皮肤老化与皮肤癌的发生有重要影响。到达地球表面引起人皮肤损伤的紫外线包括UVB(280－315nm)和UVA(315－400nm)，而同等剂量下UVB对皮肤的损伤强度比UVA约大1000倍。成纤维细胞是真皮的主要功能细胞和结构基础，是紫外线辐射的重要靶位之一。本试验结果表叫UVB照射可损伤成纤维细胞，导致细胞成长受到抑制，且成纤维细胞的损伤程度与UVB照射的剂量呈正相关。
　　IL－10，IL－12，TNF-a是皮肤免疫系统的重要组成部分。IL－10来源于Th2细胞，可以抑制巨噬细胞和Th1细胞功能，下调细胞免疫应答，但可刺激B细胞增殖和产生抗体，上调体液免疫应答。IL－10是一个多效性细胞因子，具有免疫刺激和免疫抑制双重作用，其免疫刺激作用主要是提高B细胞存活率，促进B细胞增殖、促进MHCⅡ类抗原表达以及抗体的分泌。IL－10的免疫抑制作用表现为能抑制Th1细胞的增殖和某些细胞因了的合成，其作用机制可能是IL－10作用于APC，诱导APC产生另一种细胞因子，改变细胞内信号的传递途径，从而选择性抑制某些细胞因子的mRNA转录，破坏了Th1/rh2的免疫平衡，发生偏向Th2细胞的免疫偏离，促进Th2细胞的体液免疫应答，抑制Th1及其介导的细胞免疫应答。IL－12米源于Th1细胞，是一个多功能的免疫调节因子，在调节T类细胞因子产生与维持Th1/Tc1应答优势过程中具有重要作用。IL－12由单核细胞，B淋巴细胞产生，在免疫过程中介导Th1型免疫反应，可以促进Th1细胞的增埴分化，产生Th1细胞因子，抑制Th2细胞的增殖分化。IL－12还具有调节Th1与Th2细胞之间的平衡，可促使ThO/TCO细胞分化为Th1/Tc1细胞，促进Th1/Tc1细胞增殖和分化，诱导Th1/Tc1细胞产生大量的IFN－γ，而IFN－γ反过来又能促进IL－12大量产生。TNF－a是调控机体免疫反应的重要因子，可传递细胞间信息，调节细胞功能，具有抗肿瘤，引起炎症反应和免疫调节作用。它与UVB辐射引起的皮肤损伤、炎症反应、接触超敏反应和细胞凋亡等密切相关。UVB照射后皮肤内的TNF－a主要由真皮成纤维细胞产生。我们研究了UVB对成纤维细胞细胞因子分泌的影响，结果提示UVB促进了IL－10，IL－12，TNF－a的分泌，分泌量与照射剂量相关，说明UVB导致的细胞损伤可能与三种细胞因子的分泌增加有着密切相关的联系。
　　黄芩苷是中药黄芩的活性成分，有吸收紫外线的作用。黄芩苷的主要药用成分黄酮类具有抗炎，抗氧化等生物学效应，对紫外线引起的红细胞膜氧化损伤有保护作用。川芎中的阿魏酸能有效抑制氧自由基产生，保护膜脂质小被氧化，防止DNA损伤发生，还可能抑制肿瘤细胞的增殖生长。本文的研究显示川芎和黄芩苷可减轻UVB对成纤维细胞的损伤，提高细胞增殖活性，但随着照射剂量增加，其抵抗损伤作用的能力减弱，说明其光保护作用是有限的。此外，两种单体成分均可抑制UVB辐射引起的炎性细胞因子IL－10，IL－12，TNF－a分泌，与单纯照光组相比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　综上所述，UVB对体外培养的人皮肤成纤维细胞有损伤作用，表现为细胞受损、生长抑制，其损伤程度呈剂量依赖性。UVB可促进受照射的细胞分泌IL－10，IL－12，TNF－a。川芎和黄芩苷可减轻细胞损伤，部分恢复细胞活性而具有光保护作用，抑制炎性细胞因子IL－10，IL－12及TNF－a的分泌可能是减轻紫外线辐射损伤的机制之一。这些结果为开发天然光保护剂提供了理论依据和实验数据参考，也为今后紫外线辐射引起皮肤损伤，中药防护及其机制的进一步研究打下了基础。