[水蛭素对皮肤增生性瘢痕成纤维细胞bFGF及TGFβ1表达的影响]人增生瘢痕成纤维细胞

　　[摘要]目的：检测水蛭素对人皮肤瘢痕成纤维细胞碱性成纤维细胞因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、转化生长因子β1（transforming growth factor beta 1,TGFβ1）表达的影响,探讨水蛭素抑制瘢痕形成的作用及机制。方法：体外培养并鉴定人皮肤瘢痕成纤维细胞，实时荧光定量RT-PCR和免疫细胞化学法分别检测不同浓度水蛭素作用人成纤维细胞24h后，bFGF、TGFβ1的mRNA和bFGF、TGFβ1蛋白表达水平。结果：浓度为0.156～2.5 U/L的水蛭素可下调瘢痕成纤维细胞TGFβ1 mRNA、蛋白的表达，同时上调bFGF的mRNA、蛋白的表达，不同浓度组间比较，差异有统计学意义。水蛭素可抑制增生性瘢痕成纤维细胞分泌TGFβ1，促进其分泌bFGF。结论：水蛭素抑制瘢痕可调节bFGF、TGFβ1分泌，由此抑制成纤维细胞的生长、增殖并进一步抑制瘢痕形成。
　　[关键词]瘢痕；水蛭素；成纤维细胞；碱性成纤维细胞生长因子；转化生长因子β1
　　[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2011）04-0614-04
　　
　　Effects of Hirudin on expression of bFGF, TGFβ1 in dermal hypertrophic scar fibroblasts
　　GUO Rui1,NONG Xiao-lin1，2,DENG Ling1,LI Jia-quan3,LI Ju-shang4,LI Yan-ning5,LI Hao1
　　（1.Department of Oral and Maxillofacial Surgery,Collage of Stomatology,Guangxi Medical University,Nanning 530021,Guangxi,China; 2.School Library of Guangxi Medical University，Nanning 530021,Guangxi,China;3. Medical Research Center of Guangxi Medical University,Nanning 530021,Guangxi,China; 4.Dermatology and Venerology Department, The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021,Guangxi,China; 5.Department of statistics,College of Public Health,Guangxi Medical University,Nanning 530021,Guangxi,China)
　　
　　Abstract:ObjectiveTo investigate the influence of Hirudin on the expression ofbasic fibroblast growth factor (bFGF) and transforming growth factor beta 1 (TGFβ1) in human hypertrophy scar dermal fibroblasts in vitro, therefore to explore the role of bFGF and TGFβ1 on hypertrophy scaring.MethodsHuman dermal hypertrophy scar derive fibroblasts were obtain through primary culture. Dermal hypertrophy scar fibroblasts were cultured in vitro with Hirudin for 24 hours; mRNA levels of bFGF and TGFβ1 in treated fibroblasts were detected by Realtime RT-PCR, and proteinlevels of bFGF,TGFβ1 in fibroblasts were detected by immunocytochemistry.Results0.156～2.5 U/L Hirudin statistically up-regulated level of bFGF mRNA, bFGF(P 　　1.2.2 Realtime RT-PCR检测水蛭素不同浓度作用下bFGF、TGFβ1 mRNA表达
　　1.2.2.1 药物作用后成纤维细胞总RNA的提取和检测：取对数生长期增生性瘢痕及正常皮肤成纤维细胞接种于25cm2的培养瓶中，标本置于含青霉素100U/ml，链霉素100mg/L的D"hanks液中培养3天后，更换为无血清的浓度为0 U/L、0.156U/L、0.625U/L、2.5U/L的含水蛭素培养液，于37℃、5%CO2的培养箱中继续培养，24h后将经形态学及免疫细胞化学SP法鉴定的细胞按TRIZOL法的操作步骤提取总RNA，并以OD260/OD280比值为依据测定总RNA的纯度和浓度。
　　1.2.2.2 cDNA合成：各处理组提取的总RNA各取2ng进行逆转录，5×PrimeScriptTMBuffer 2μl，Random 6mers 0.5μl，PrimeScriptTM RT Enzyme Mix 0.5μl，Oligo dT Primer 0.5μl，并补足RNase Free H2O使体系为10μl，37℃ 15min，85℃ 5s。逆转录产物-20℃保存备用。
　　1.2.2.3 引物合成：根据Genebank人bFGF、TGFβ1的cDNA序列，结合文献，利用软件Primer Premier 5.0设计特异引物，选用保守的GADPH为荧光实时定量RT-PCR内参基因。所有引物由大连TaKaRa公司合成（见表1）。
　　1.2.2.4 反应体系和反应条件
　　(1) cDNA的制备：冰浴下,在0.5mlEppendorf管内依次加入5×PrimeScriptTMBuffer 2μl、Random 6 mers0.5μl、PrimeScriptTM RT Enzyme Mix 0.5μl、Oligo dT Primer 0.5μl、RNA模板2μl、RNase Free H2O 4.5μl。每管总体系10μl,混匀离心2～3s。反应条件为37℃ 15min，85℃ 5s。逆转录产物-80℃保存备用。
　　(2) 荧光定量RT-PCR反应：反应体系为：10×PCR Buffer 2.5μl、25mM MgCl22.5μl、10 mM dNTP 0.5μl、上下游引物各0.5μl、Taq DNA(1U/μl) 0.5μl、20×SYBR Green Ⅰ染料 1μl、模板 2μl，加灭菌去离子水至总体积 25μl。
　　（3） 反应循环：95℃预变性10s，1个循环5min；95℃ 变性45s；72℃ 延伸 60 s；退火温度bFGF为 58℃，TGFβ1为61℃，内参基因GAPDH为62℃共40个循环。整个反应过程中荧光信号的变化由实时荧光定量 PCR仪监测。所有样品检测实验均包含1个无模板的阴性对照以排除假阳性结果。
　　1.2.2.5 Real-Time PCR 产物定量分析：PCR反应结束后，由电脑自动分析并计算结果（依据标准曲线，根据未知样本的CT值计算出该样品对应的起始cDNA水平）。结果以拷贝数/μl cDNA表示，并以此比值做统计学处理。
　　1.2.2.6 琼脂糖凝胶电泳：为进一步确认 PCR反应的特异性，将bFGF、TGF1扩增产物在2.5%琼脂糖凝胶中进行电泳。一旦PCR产物的长度确认，即应用SYBRGreen I实时定量PCR熔解曲线中的熔解温度Tm监测反应特异性。
　　1.2.3免疫细胞化学检测不同浓度青蒿琥酯钠作用下bFGF、TGFβ1蛋白的表达
　　1.2.3.1 药物作用：取前述实验分离的对数生长期的3～6代实验组、对照组成纤维细胞，用0.25%胰蛋白酶消化成单细胞悬液，调为1×105/ml，分别接种于6孔板中，将消毒处理后的盖玻片置于孔板中，常规培养72h后吸弃原培养液。用培养液稀释成0.156U/L，0.625U/L，2.5U/L的含水蛭素培养液。每浓度设3个复孔。于37℃，5%CO2饱合湿度继续培养24h。
　　1.2.3.2 免疫细胞化学染色：取出生长细胞后的盖玻片，常规固定、晾干、PBS冲洗；5～10%正常山羊血清封闭；分别滴加兔抗人bFGF、TGFβ1多克隆抗体（抗体滴度为1:200，4℃过夜）；1%BSA-PBS稀释的生物素标记二抗（37℃孵育30min）；PBS稀释的辣根酶标记链霉卵白素（37℃孵育30min）；DAB显色剂显色；苏木精复染；中性树胶封片。在染色过程中，每例均以PBS缓冲液代替一抗作空白对照。
　　1.2.3.3 观察方法和结果判定：bFGF、TGFβ1阳性产物定位于细胞胞浆,显微镜下细胞浆染成棕黄色。采用德国莱卡病理图像分析仪（DMR+Q550型）进行灰度值测定分析。
　　1.2.4 统计分析：利用SPSS13.0软件，计量资料采用成组设计方差分析及两两比较，实验结果均以均数士标准差(x±s)表示。检验水准α=0.05，P 　　成纤维细胞是重要的创伤修复细胞，它可以分泌多种细胞因子参与创口的愈合。在瘢痕形成过程中，正向与负向两类细胞因子调控成纤维细胞的增生与代谢活动，从而决定胶原等细胞外基质形成与降解之间的动态平衡。这些细胞因子表达水平及功能的变化，可能导致成纤维细胞的过度增殖和胶原基质的过度沉积，进而形成病理性瘢痕。转化生长因子β1(TGFβ1)是一种纤维化促进因子，是目前已知的与病理性瘢痕关系最密切的细胞因子，TGFβ1可促进瘢痕成纤维细胞增殖，增强纤维蛋白和胶原分泌[8-9]。碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）是成纤维细胞生长因子家族原型，可通过与成纤维细胞膜上的受体结合，下调病理性瘢痕组织中I型前胶原mRNA表达，提高胶原酶mRNA水平，刺激胶原酶合成[10]，减少硫酸软骨素粘多糖产生，抑制纤维素合成，防止过量的细胞外基质沉积[11]。
　　本实验采用天然水蛭素作用于体外培养的增生性瘢痕细胞，实验结果显示：水蛭素可下调 TGFβ1 mRNA和蛋白水平表达，同时上调bFGF的mRNA和蛋白水平表达，作用效果呈剂量依赖性。提示水蛭素这种药物对瘢痕应有治疗效果。据此推测其治疗机制为，水蛭素可能抑制TGFβ1在瘢痕发生初期的表达，减少组织中成纤维细胞的增殖和以胶原为主的细胞外基质的沉积，避免大量的纤维化组织形成，进而防止瘢痕增生；而水蛭素可能促进bFGF下调病理性瘢痕组织中 I型前胶原 mRNA表达，刺激胶原酶合成，防止过量的细胞外基质的沉积。并且体内各种细胞因子具有网络调控的特点，它们相互促进与拮抗，相互调节受体的表达。
　　探明细胞因子在创伤修复及皮肤病理性瘢痕形成中所起的作用，有助于明确瘢痕形成的机制；而开发利用中药、天然药物对皮肤瘢痕修复过程的中良性调节机制是今后研究的又一个突破点，不失为瘢痕防治一种好的选择。
　　
　　[参考文献]
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　　[收稿日期]2011-01-26[修回日期]2011-03-20
　　编辑/张惠娟