国内最好的芸苔素内酯【聚己内酯电纺纤维的制备及生物相容性研究】

　　[摘要]目的：评价聚己内酯电纺纤维的生物相容性，对其在组织工程支架方面的应用前景进行探讨。方法：采用静电纺丝法制备聚己内酯纳米纤维，场发射扫描电镜观察其表面形貌及内部结构，通过溶血实验、粘膜刺激实验和细胞毒性实验(MTT法)初步评价其生物相容性。结果：场发射扫描显微镜观察显示所获得纤维呈无纺多孔网状结构，直径范围为153～612nm，纤维形态光滑均一。溶血实验显示材料无溶血现象，不影响凝血功能；MTT试验显示L929细胞在材料浸提液种中生长良好，细胞毒性为0级；粘膜刺激实验未见异常组织学反应。结论：聚己内酯电纺纤维具有良好的生物相容性，对其在组织工程支架材料领域的应用有进一步研究的价值。
　　[关键词]电纺技术；聚己内酯；生物相容性
　　[中图分类号]R783.1 [文献标识码]A　[文章编号]1008－6455(2007)05－0603－04
　　
　　聚己内酯(Polycaprolactone，PCL)是由ε－己内酯开环聚合所得到的线性脂肪族聚酯，具有良好的热稳定性、生物降解性、力学性能、药物通过性和生物相容性，其降解产物对人体无毒。目前该材料已经获得美国FDA的批准，广泛应用于骨折固定材料、手术缝线、医用敷料、药物控释材料和组织工程支架材料等领域。电纺技术是一种利用聚合物溶液或熔体存强电场作用下形成喷射流获取超细长纤维的新型工艺。目前已有近百种聚合物成功地通过这一技术获取了超细纤维并被陆续心用于膜技术、增强材料、纺织品、光学传感器、医药释放体系和组织工程等诸多领域，引起了人们的广泛关注。本研究采用电纺技术制备聚己内酯纳米纤维，并对其形态结构和生物相容性进行了研究，初步论证了其作为组织工程支架材料的潜力。
　　
　　1　材料和方法
　　
　　1.1　材料：聚己内酯(PCL，美国Sigma公司，Mn＝80000)，二甲基甲酰胺(DMF，西安化学试剂公司，AR)，氯仿(DMF，西安化学试剂公司，AR)，BGG40/2高压直流电源(北京机电研究所0－30KV)，JSM－6700F型扫描电镜(日本JEOL公司)，BX41型光学显微镜(日本Olympus公司)，MPS－UV260型紫外分光光度仪(日本岛津公司)，酶联免疫检测仪(美国Bio－Tek公司)，DMEM培养液(美国GibcoBRL公司)，胎牛血清(浙江金华清湖犊牛利用研究所)，胰蛋白酶(上海浦东生化试剂厂)，MTT(美国Sigma公司)，Image－Pro Plus5．02图像分析软件(美国Media Cybernetics公司)。6月龄新两兰大耳白兔，1只，雄性，体重1.5kg(第四军医大学实验动物中心)；昆明成年小白鼠，16只，体重18～22g(第四军医大学实验动物中心)；60～70天金黄色地鼠，10只，体重140～160g(西安交通大学动物实验中心)。小鼠结缔组织成纤维细胞L－929细胞株(第四军医大学口腔生物实验室)。
　　
　　1.2　方法
　　1.2.1 PCL电纺纤维的制备与表面形貌表征：以氯仿／DMF(体积比2:1)的混合溶液为溶剂，配制浓度为8％的PCL溶液。将纺丝液加入一个安装有8号不锈钢注射针头的自制玻璃加样管，针头与的正极相连，针头亦即喷丝口下方安装一个接地的铜板，上覆铝箔作为纤维的接收屏。在喷丝口和接受屏之间形成一个高压电场，从喷丝口流出的纺丝液在电场力的作用下以高速不规则的螺旋轨迹运行，并被拉伸成为超细纤维沉积到接受屏上，在这个过程中溶剂挥发，纺丝细流固化。在外加电压10kV，接收距离12cm，溶液流量3ml/h的条件下最终的获得直径为亚微米级甚至纳米级的纵横交错的无纺纤维毡，置丁干燥器中干燥保存。纤维样品经真空蒸镀仪喷金，导电胶固定，以冷场发射扫描电子显微镜JSM－6700F观测纤维表面的形貌表征，电子加速率为5kV。采用Image－Pro Plus5.02测定电镜照片中的纤维直径。
　　1.2.2　溶血试验：将PCL电纺纤维切割为50mm×3mm条状放入无菌试管，完全浸没于20ml DMEM培养液中，置于37℃培养箱中72h，获得浸提液。心脏穿刺抽取新西兰大耳白兔血10ml，立即加入20g/L的草酸钾0.5ml，抗凝，取8ml兔血加入10ml生理盐水中稀释备用。实验分为3组，每组平行3份试样。阴性对照组：0.2ml稀释兔血加入10ml生理盐水；阳性对照组：0.2ml稀释兔血加入10ml双蒸水；PCL电纺纤维组：0.2ml稀释兔血加入10ml浸提液。37℃水浴60min，离心，取上清。在MPS－UV260型紫外分光光度仪上测A540nm值。溶血率计算公式为：溶血率(％)＝(实验组光吸收度－阴性对照光吸收度)／(阳性对照光吸收度－阴性对照光吸收度)×100％。溶血率大于5％，则预示阳性结果。
　　1.2.3　短期全身毒性试验：将PCL电纺纤维研磨粉碎后高温高压消毒，无菌条件下配制成100g/L生理盐水混悬液，使用前37℃下保持1h。选用昆明小鼠随机分配为PCL电纺纤维实验组和阴性对照组，每组各8只。实验组采用胃内针给药，1g/kg。对照组给以等量的生理盐水。连续给药7天，停药后继续观察7天。每日检查动物的临床中毒体征，并予以记录。停药7天后，采用颈椎脱臼法将动物处死。取动物心、肝和肾，置于多聚甲醛固定液中，常规HE染色后BX41型光学显微镜下观察。
　　1.2.4　口腔粘膜刺激试验：金黄色地鼠腹腔注射10g/L的戊巴比妥钠麻醉动物，消毒，铺巾。用医用缝合线将与试样穿颊粘膜缝合固定到颊囊粘膜上，每只固定经消毒备用的2个试样，左侧为实验组PCL电纺纤维试件，右侧为作为阴性对照的牙胶圆片。术后每日观察粘膜组织反应及试样在位情况，即试片周围有无充血、糜烂、肿胀等。术后14天处死动物，取与材料接触的颊囊部全层组织，HE染色，BX41型光学显微镜进行观察。
　　1.2.5　细胞毒性试验：按照CB/T16886.5－2003《医疗器械生物学评价》体外细胞学毒性试验的试验方法进行。选择L－929细胞为受试细胞株，实验前用PBS新鲜配制MTT溶液，微孔滤器过滤除菌，4℃保存。取对数生长期的细胞系，常规胰酶消化后制备成单个细胞悬液，调整细胞密度为1×106L，接种细胞于96孔培养板(100ul／孔，n＝5)置于5ml/LCO2，37℃培养箱中，在饱和湿度条件下培养48h。然后将浸提液加入各实验组(150ul／孔)。阴性对照为DMEM培养基，阳性对照为1ml/L苯酚，常规培养。培养12h，24h和48h后酶联免疫检测仪测定A570nm，值，并计算出各组的A570nm均值及细胞增殖百分率(P％)。P％＝各浓度组A570nm均值／阴性对照组 A570nm均值×100％。按照CB/T16886.5－2003标准，P％可分为6级：＞100％为0级；75％～100％为I级；50％～74％为II级；30％～49％为III级；15％～29％为Ⅳ级；0～14％为v级。只有细胞毒性为I级或0级的牛物材料才能用于体内实验。
　　
　　2　实验结果
　　
　　2.1 PCL电纺纤维形貌扫描电镜观察：5000倍扫描电镜下可见PCL电纺纤维呈相互交联的多孔网状无纺结构，纤维交错相叠、光滑均 ，没有明显的珠状膨大结构或者纤维粘并现象。根据所采集的图像用Image－Pro Plus软件测量出电纺纤维的直径变化范围为153～612nm，平均值为285nm。
　　
　　2.2　溶血试验结果：各测试组光吸收度测定值见表1，以每组测定值的平均数计算溶血程度，溶血程度为1.40％，小于5％，即PCL电纺纤维无溶血反应。
　　
　　2.3　短期全身毒性试验：所有小鼠胃内灌入混悬液后动物在2周内般情况良好，活动、进食情况正常，体质量无下降，无步态不稳、惊厥、瘫痪、呼吸困难等不良反应，无死亡。各组小鼠心、肾、肝的组织切片均未见细胞变性、坏死等病理变化，实验组与对照组无差异。
　　
　　2.4　口腔粘膜刺激试验：各组金黄色地鼠进食、饮水正常，毛发光泽度佳，反应灵活。肉眼观察，材料接触处口腔粘膜表面未见明显充血、肿胀、糜烂或溃疡。组织切片观察，阴性对照组，颊粘膜粘膜上皮排列整齐，细胞形态正常，较少量炎性细胞浸润，粘膜下结缔组织中有少量血管扩张和充血。PCL电纺纤维实验组颊粘膜各层细胞排列整齐，较少量炎性细胞浸润，粘膜下结缔组织中有少量血管扩张和充血。实验组与阴性对照组的组织学观察结果相似，均未见明显异常反应。细胞毒性分级见表2。倒置相差显微镜观察阳性对照组，正常细胞形态消失，核固缩或溶解，而实验组细胞形态良好，细胞折光性强，与阴性对照组相似，并可见多个分裂相细胞，表明细胞生长旺盛。细胞毒性测试为0级，说明PCL电纺纤维对L－929细胞无抑制作用。

　　3　讨论
　　
　　电纺技术的原理为：强电场作用下聚合物溶液或熔体克服表面张力在纺丝喷头毛细管尖端形成射流，当电场强度足够高时，在静电斥力、Coulomb和表面张力的共同作用下，聚合物射流沿不稳定的螺旋轨迹弯曲运动，在几十毫秒内被牵伸千万倍，随溶剂挥发，射流固化形成亚微米至纳米级超细纤维。利用电纺技术制备组织工程支架材料的优势在于：能够制备出比表面积大、孔径小、孔隙率高、纤维均一生好，直径与细胞外基质内胶原纤维相近的连续超细纤维(50～500nm)，从而最大程度的模仿细胞外基质天然结构；制备方法简单快捷，支架材料可以是单一的聚合物，也可以是多种聚合物的复合体，并可以在支架中引人无机粒子(如羟基磷灰石等)、生长因子甚至活细胞等：通过选择适当的材料和加工参数，能够调控所制备支架材料的孔隙率、厚度、三维结构、降解率和力学性能：利用同轴电纺技术能够将生物活性分子加入到聚合物支架中，活性因子的有效释放提供了理想平台。实验中获得的PCL电纺纤维大体外观为白色膜状结构，SEM观察显示纤维外观光滑，直径均一，纤维直径153～612nm，为纳米级多孔无纺纤维，其相瓦交错的多孔结构与天然细胞外基质的胶原纤维结构近似，这种结构有利于细胞的粘附和生长，在组织工程支架和医用敷料等方面有一定的应用前景。
　　种子细胞与支架材料是组织工程的两个核心因素。组织再牛的生物学特性要求支架材料不但要具备促进细胞粘附、分化和表型表达的三维结构，而且还要为组织再生提供一定的力学支撑，植入体内后具备良好的免疫原性，不发生急、慢性免疫排斥反应及近、远期毒性反应等。而良好的生物相容性，是理想支架材料的首要条件。生物相容性是指生命体组织对非活性材料产生反应的性能。一般是指材料与宿主之间的相容性，包括组织相容性和血液相容性。对生物材料相容性评价方法较多，国际标准化组织公布的医疗器械生物学评价试验指南(ISO标准，1997)中基本评价的生物学试验包括细胞毒性、致敏、刺激或皮内反应、全身急性毒性、亚慢性亚急性毒性、遗传毒性、植入、血液相容性等。本课题选择了溶血实验、短期全身毒性实验、口腔粘膜刺激实验和细胞毒性试验这四种较为常见的生物学试验方法。试验结果显示PCL电纺纤维不引起溶血反应，不干扰细胞功能，对口腔粘膜显示无刺激性，无短期毒性作用，具有可靠的生物安全性，是一种具有良好生物相容性的材料，具有进一步应用于组织工程支架材料研究的前景。
　　
　　编辑　张惠娟
　　
　　基金项目：国家自然科学基金(批准号：30500118)，陕西省自然科学基金(批准号：2006E124)
　　
　　通讯作者：张少锋，男，敦授，主任医师，E－mail：sfzhang@fmmu.省略