[构建组织工程化耳廓软骨修复体]耳廓修复

　　张 路 综述 周广东 曹谊林 审校 　　 　　因先天性小耳畸形、外伤、肿瘤造成的外耳缺损或缺失在临床中较为常见。目前治疗的手段主要是采用切取的自体肋软骨，并对其雕刻成型重建患耳[1-2]。但其不同程度的存在耳廓造型不一，供区继发缺损等问题。组织工程技术[3]的出现无疑为无（微）创修残补缺提供了可能。目前的软骨组织工程技术主要是利用自体软骨细胞或成体干细胞作为种子细胞，接种在具有三维多孔结构的可降解支架上，通过特定的培养构建方法，最终形成软骨组织以修复缺损。
　　
　　1目前已有的报道：
　　目前PUBMED上可以检索到构建组织工程化耳廓软骨修复体的相关文献共9篇[4-12]（从1997年～2007年），按照发表时间，期刊名称、作者、实验所用组织工程支架材料、种子细胞、耳廓形态和构建方法等顺序总结如表1。
　　
　　2存在的问题
　　2.1 种子细胞：以上文献所用的种子细胞均为自体或异体软骨细胞。软骨细胞是组织工程软骨研究最早，也最常采用的种子细胞来源。但从机体自身软骨组织获取细胞，一方面会造成供区继发软骨缺损，另一方面从供体组织获取的软骨细胞的增殖能力有限，容易在体外培养扩增的过程中出现去分化现象[13-14]，失去软骨细胞表型，所以不能满足大体积组织工程化软骨形成的细胞数量要求。目前认为较有临床应用前景和可行性的组织工程软骨种子细胞是间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs），这些MSCs取材创伤小，增殖力强，能被定向诱导为软骨表型细胞[15-18]，有望解决软骨组织工程种子细胞来源不足的难题。
　　2.2 支架材料：以上文献所采用的支架材料分为两类，一类是当前组织工程支架材料方面最常选用的聚羟基乙酸及其类似纤维合成聚合物，因其具有良好的生物相容性和生物可降解性，并已充分证实了其与软骨细胞复合构建成熟软骨组织的稳定效果[19-20]。但是，要将棉絮样的无纺聚羟基乙酸纤维加工预塑形成精确的耳廓形态一直是一大难题。另一类是凝胶状支架材料，如Pluronic F-127，纤维蛋白胶等，复合细胞后是修补小面积不规则缺损的理想支架材料，但作为具有特定形态的大器官构建（如耳廓，气管，外鼻软骨等）用还存在塑形困难及力学强度不足等问题。同时，使用该类支架不利于体外构建。
　　2.3 组织构建：目前已有的报道多集中于应用软骨细胞与手工制作的耳廓形态支架材料复合后植入免疫缺陷动物（如裸鼠）体内构建耳廓软骨，但其存在取膜工艺复杂、所得耳廓软骨产物由健侧耳所得、外型不佳等问题，造成该修复体缺乏临床应用价值（尤其针对先天或后天性外耳畸形或缺损病例）。此外，细胞-支架材料复合物能否在免疫功能健全的动物体内形成成熟的软骨，而不至于被排斥、吸收及受压变形有待进一步证实。所以，建立稳定的具有免疫功能的大动物模型是未来组织工程软骨真正实现临床应用的必经之路。
　　
　　
　　3临床应用尚需解决的问题
　　3.1 可塑性：组织工程化耳廓修复体要实现临床应用，首先要解决的是可塑性的问题。目前，要把生物支架材料加工成个体差异非常大的、与健侧耳相对称的耳廓修复体还是一大难题。计算机辅助设计(Computer Aided Design, CAD)和快速成型(Rapid Prototype, RP)技术[21-22]的出现无疑为这一问题的解决提供了一种可能。它能将病人的正常耳廓数据导入计算机并进行个性化设计，再通过生物打印技术将组织工程用支架材料直接打印出来，从而可以直接对细胞进行接种。此外，该支架复合细胞后所构建的产物要有足够的强度去对抗植入人体皮下所带来的张力从而维持原先的形状，这对支架材料的强度提出了新的要求。
　　3.2 修复体外露及吸收：修复体外露及吸收容易发生在早期细胞支架复合物植入过程中，由于支架尚未完全降解甚至细胞及其细胞外基质尚未充分包埋支架，容易造成机体对支架及其降解产物的无菌性炎症反应，炎症细胞侵润，释放炎性因子，交界面无法愈合，从而造成修复体外露及吸收。因此，细胞支架复合物的体外预构建十分重要，不仅可以使支架降解、细胞及其细胞外基质充分包埋，同时也可以对植入物进行必要的生物相容性检测及生物力学检测。
　　3.3 无法控制的细胞增殖：在应用干细胞作为种子细胞进行诱导构建软骨的过程中，干细胞的安全性问题一直是争论的焦点。尤其是胚胎干细胞，其高度的成瘤性[23-24]将直接限制其临床应用。而成体干细胞被认为无成瘤性，但目前尚缺乏体内长期追踪及人体临床试验的安全性证据。
　　3.4 耳廓软骨的性质：耳廓软骨是人体最大的弹性软骨，组织学和生物力学性质都与其它类型的软骨（包括透明软骨及纤维软骨）有所不同，因其细胞外基质内含有弹性纤维。而目前所构建的组织工程化软骨尚无法形成含有类似正常弹力纤维的软骨，也缺乏相关研究的报道。
　　3.5 供区损伤：尽管组织工程的种子细胞可以在体外不断扩增培养，但以软骨细胞为例，因其增殖能力有限，容易在体外扩增的过程中出现去分化现象。所以取材时需要对较大的软骨块进行细胞收集。排除肋软骨取材的并发症，肋软骨本身细胞/基质比很低，会造成不宜消化及所得相对细胞数较少等问题，因此不利于临床应用。而按照目前构建正常耳廓所需的软骨种子细胞数量（大约4～5×108），单纯切取小块鼻中隔软骨及耳甲腔软骨用以收集细胞是不能满足要求的。而应用成体干细胞作为种子细胞构建软骨，其供区损伤要相对小得多。
　　3.6 细胞扩增：软骨增殖能力有限，容易在体外扩增的过程出现去分化现象，所以目前一般用到第3代细胞已经是极限。而成体干细胞增值能力非常强，可以以极低密度传代，理论上可以获得足够量的细胞。但就目前的细胞培养条件而言，一个10cm直径的培养皿平均只能容纳106～107个细胞，这样就需要耗费大量的人力、财力和时间，因此很难实现临床推广。而目前出现的微载体细胞培养方法[25-28]大大提高了细胞扩增培养的效率，有望解决细胞扩增的问题。
　　3.7 可能出现的伦理学问题：虽然医生们对干细胞技术及其应用持欢迎态度，但目前还是有很多国家法律立法限制其研究，尤其是针对胚胎干细胞。因为它很大程度上与生命的起源相关联。
　　
　　4总结
　　近10年来，组织工程技术在医学各个领域都取得了长足的进步，其中组织工程化耳廓软骨是几个比较具有实践性和应用性的组织工程产品之一，它是组织工程基础研究向临床应用转化的必然过程，虽然还有不少问题有待解决。但笔者相信，随着我国863、973等重点科技计划项目对组织工程进行立项，以及国内外组织工程研究热潮的兴起，新技术、新材料、新发明的不断涌现，不久的将来可以看到类似于组织工程化耳廓软骨等相关产品应用于整形外科乃至整个医学科学领域。
　　
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　　[收稿日期]2008-07-25[修回日期]2008-09-27
　　编辑/张惠娟