[局部转染CTLA-4Ig抑制大鼠异体复合组织移植急性排斥反应的研究]大鼠植入后局部反应实验

　　[摘要]目的:观察腺病毒介导融合基因细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(cytotoxic T-lymphocyte associated antigen-4,CTLA-4Ig)局部转染大鼠同种异体移植的复合组织对急性排斥反应的抑制作用。方法:以近交系Brown Norway大鼠为供体,Lewis大鼠为受体,采用腹部游离皮瓣作为异体复合组织移植(composite tissue allotransplantation,CTA)模型。将受者分为3组,A组(空白对照组):异体皮瓣离体保存时不感染腺病毒,只灌注PBS溶液;B组(阴性对照组):异体皮瓣离体保存时灌注携带增强型绿色荧光蛋白的重组腺病毒(Ad-EGFP);C组(基因治疗组):异体皮瓣离体保存时灌注AdCTLA-4Ig。术后观察各组移植皮瓣的排斥情况及存活天数,进行组织病理学检查,并观察CTLA-4Ig在移植组织中的表达情况及对急性排斥反应的抑制作用。结果:①A组、B组皮瓣移植物平均生存时间分别为(7.8±1.5)天和(7.1±1.6)天,C组移植皮瓣平均存活时间为(10.4±2.3)天,C组存活期长于A组和B组,差异有统计学意义(P 　　
　　1材料和方法
　　
　　1.1 实验动物:供者为Brown Norway(BN,RT1n)大鼠,受者为Lewis(RT11)大鼠。供、受者均为近交系健康大鼠,雄性,体重200～300g,均购自北京维通利华实验动物有限公司,并由第四军医大学实验动物中心按SPF级条件进行饲养。
　　1.2 重组腺病毒:AdCTLA-4Ig为携带人CTLA-4Ig基因的5型非增殖型腺病毒,滴度为4×109蚀斑形成单位(PFU)/ml;对照病毒AdEGFP为EGFP基因的5型非增殖型腺病毒,滴度为4×109 PFU/ml。均由上海医元生物基因科技发展有限公司提供。
　　1.3 实验分组:实验随机分为三组,每组10只。A组(空白对照组)供瓣离体期间以PBS溶液灌注;B组(阴性对照组)供瓣离体保存时灌注携带EGFP基因的重组腺病毒AdEGFP 1×109 PFU;C组(AdCTLA-4Ig转染组)供瓣离体保存时灌注携带CTLA-4Ig基因的重组腺病毒AdEGFP 1×109 PFU。
　　1.4 同种异体复合组织移植模型的建立:本实验以Brown Norway大鼠为供体,Lewis大鼠为受体,以股动、静脉为蒂进行同种异体腹部游离皮瓣移植,作为复合组织移植的模型。1%戊巴比妥钠(产自佛山市实验化工厂)按50mg/kg腹腔注射麻醉成功后,在腹股沟处找到股动脉搏动点,在其上方设计一大小3cm×2.5cm腹部皮瓣。沿腹肌肌膜表面小心切开皮瓣,可见皮瓣由皮肤和其下的肉膜组成。分离出腹壁浅动静脉和股动静脉,结扎并剪断股动静脉肌穿支。皮瓣游离。
　　经股动脉断端插管,并以6-0丝线结扎固定,通过1ml注射器和微量推注泵先向皮瓣内灌注1ml PBS溶液,直至皮瓣静脉流出液无色,以冲出残留血液。随后在120mmHg的压力下向其中灌注病毒液1×109 PFU,灌注完毕后以显微血管夹夹闭股动脉及股静脉,皮瓣浸于PBS缓冲液,37℃孵箱中4h后,打开血管夹。解剖受体股动静脉,供、受体股动静脉端端吻合,缝合肉膜、皮肤。手术完成。手术当天及术后3日内肌注青霉素钠50 000U/kg,2次/日。
　　1.5 大体标本的观察:术后定期观察各组移植皮瓣存活情况及急性排斥反应发生过程、排斥反应外观的轻重程度以及皮瓣存活时间,以此评价局部转染AdCTLA-4Ig对急性排斥反应的抑制作用。
　　1.6 组织病理学检查:分别在术后第3、5、7、11天,采集异体皮瓣皮肤标本进行病理学检查,评估排斥反应的程度。样本应用10%福尔马林固定,然后储存于70%的酒精中,切片,应用HE染色,进行病理学分析。病理学分析对象包括组织结构、血管周围炎、毛囊周围炎、真皮炎症和表皮变性程度等发生情况。
　　1.7 ELISA法测定血清中IL-2水平:各组皮瓣存活受者于移植术前和移植后第3、7、11天经断尾取血1ml,采集的血液置37℃水浴1h,3 000r/min离心20min后,收集上清,分装3～4管,-80℃保存。采用定性双抗体夹心法,按IL-2 ELISA试剂盒(R&D Systems,Inc)说明书的步骤测定血清中IL-2的水平。
　　1.8 统计学分析:在统计教研室的指导下,应用SPSS13.0统计软件进行统计学分析。各组所得数据用均数±标准差表示,进行t检验,P
　　2.2 病理学检查结果:A组与B组组织病理学表现无明显差异,术后3天可见白细胞增多,以淋巴细胞增多为主,伴单核细胞浸润,炎细胞多围绕在血管及毛囊周围,真皮层水肿明显;术后第7天真皮水肿减轻,而淋巴细胞浸润增多,出现典型的血管炎和毛囊炎,多处表皮分离,结构模糊甚至脱落消失。C组术后3天表现与A、B组无明显差异,可见白细胞浸润及真皮层水肿;术后7天示真皮水肿减轻,少量淋巴细胞浸润,出现轻微血管炎及毛囊炎,但皮瓣组织结构清晰,无明显损伤;术后11天病理学检查示淋巴细胞浸润增多,以单核细胞为主,并出现较典型毛囊炎与血管炎,真皮水肿增厚,表皮分离,组织结构模糊。
　　2.3 各组大鼠血清IL-2表达的比较:各组移植前后血液IL-2水平见表2。移植术前各组间比较,差异无统计学意义(P均>0.05),A、B组术后第3、7天血清IL-2水平均高于C组,差异具有显著统计学意义(P均0.05)。分析表2,并和表1对比,可以看出移植后各组IL-2的水平明显升高,并与排异反应的程度相关,如A、B组术后第7天皮瓣排异反应发生后,IL-2的水平显著升高。C组皮瓣灌注AdCTLA-4Ig进行局部基因转染后,可以使IL-2显著上升的时间推后,异体皮瓣的存活时间延长,但是皮瓣局部灌注AdCTLA-4Ig不能有效地控制排异反应,IL-2的水平也会显著增加,最终由于全身排异反应的不断增强,皮瓣发生排异反应而死亡。
　　　　3讨论
　　
　　同种异体复合组织移植(CTA)临床应用已经初步获得成功,显示了其在体表组织器官缺损修复中良好的应用前景[2]。由于包含抗原性较强的皮肤组织,异体复合组织移植较心、肝等实体器官移植更容易发生排斥反应,特别是术后早期阶段,需要全身使用大剂量免疫抑制药物抑制急性排斥反应,而这些药物具有较多的毒副作用,如肝肾及其他脏器损害、糖尿病等,受者甚至面临发生致死性感染和肿瘤的危险[2]。第一例异体颜面复合组织移植的患者术后出现了肾功能损伤[3],第二例颜面复合组织移植的患者出现了高血糖症[4]。这些副作用是影响复合组织移植在临床上推广应用的主要原因。因此,如何抑制术后早期急性排斥反应,降低全身免疫抑制药物的应用剂量是目前亟需解决的问题。
　　CTLA-4作为免疫抑制及诱导免疫耐受的基因治疗靶分子近年来备受学者们的关注。通过基因重组,将CTLA-4分子胞外功能区与免疫球蛋白IgG恒定区相结合,形成融合蛋白CTLA-4Ig ,其与B7分子具有高度的亲和力,可以和CD28竞争结合抗原提呈细胞(APC)上的B7家族分子,阻断CD28与B7的信号传导通路,抑制T细胞活化所需的第二信号的产生,导致T细胞的免疫失能,诱导对特异性抗原的免疫耐受[5]。人和鼠的CTLA-4基因高度同源,人CTLA-4也可与大鼠B7分子结合,阻断其第二信号途径[6]。CTLA-4Ig在血浆中的半衰期只有30h,需要反复给药,而CTLA-4Ig基因转染可使受者体内的CTLA-4Ig在一次转染后持续表达。目前基因治疗主要有两种方式,即间接体内法(ex vivo)和体外法(in vivo)[7]。前者需要先将目的基因转染到体外培养的细胞后再进行移植,它的优点是选择细胞简单,转导的细胞可严格控制,没有病毒颗粒或其他物质直接进入体内。后者是将目的基因装配于特定的真核细胞表达载体,然后利用表达载体系统直接导入体内。腺病毒(Ad)具有较高的转染效率,是目前研究应用最多的基因载体,一次转染后受体血清目的蛋白可于第3天开始表达,第7天到达峰值,其后微量表达较长一段时间[8]。
　　心、肝、肾等实体器官移植的有关研究结果表明,移植器官体外灌注腺病毒载体可以在不影响其他器官及组织的情况下,获得高浓度的区域性免疫抑制效果,延长移植物存活时间,但实体脏器对热缺血耐受时间较短,其体外灌注多在4℃的冷保存下进行,且时间多在1h左右[9-10]。 有研究表明,移植物局部灌注病毒载体,在37℃下的转染效率明显高于4℃下的转染效率,如果提高体外孵育温度、延长灌注时间,则能提高局部转染效率[8]。但时间越长,移植物活力下降越多,吻合血管后缺血再灌注损伤必然也越大。与实体器官不同,包含皮肤的复合组织在生理温度(37℃)下的耐缺血能力明显优于心、肝、肾等实体器官。因此可考虑在体外37℃下进行较长时间的药物灌注孵育,转染效果可以明显增强,从而获得更好的移植物局部免疫抑制效果,延长移植物存活。
　　本实验利用复合组织皮瓣移植物的这一特点,采用近交系大鼠下腹部游离皮瓣移植模型,将CTLA-4Ig基因重组腺病毒经皮瓣供养动脉灌注,并夹闭皮瓣静脉、动脉,在37℃下进行较长时间孵育,从而提高转染效率,并能减轻腺病毒全身转染可能带来的风险[11]。实验组(C组)术后第5天皮瓣血管壁与管周组织内能定性检测到CTLA-4Ig阳性表达,而对照组(A组、B组)未见CTLA-4Ig阳性表达,说明皮瓣局部灌注AdCTLA-4Ig后,腺病毒可穿过血管壁进到周围组织并表达目的蛋白,复合组织皮瓣移植物局部进行CTLA-4Ig基因体外转染是可行的。
　　IL-2水平是评价机体免疫状态的重要指标之一。本实验中各组移植术后早期发生急性排斥反应时,IL-2均有明显升高,但实验组血清IL-2水平在第3天、第7天时均明显低于两对照组(P