荔枝果皮中的美白剂根皮苷的提取、纯化及鉴定_荔枝果皮提取物

　　[摘要]目的：在荔枝果皮中提取和纯化皮肤美白剂、抗氧化剂根皮苷，并进行结构鉴定。方法：新鲜荔枝果皮阴干，用70％乙醇溶液以超声波浸提法提取，提取液经过D101大孔树脂吸附层析、C18小柱固相萃取、高效液相色谱法（HPLC）分离、纯化后，采用质谱法(MS)鉴定结构。结果：通过与根皮苷标准品对照，提取物的质谱图与根皮苷标准品的质谱图相符。结论：荔枝果皮中含有根皮苷，采用70%乙醇溶液超声波浸提法可成功从荔枝果皮中提取到根皮苷。
　　[关键词]荔枝果皮；根皮苷；提取；纯化；鉴定
　　[中图分类号]Q946.83[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2008）07-1032-03
　　
　　Extraction, purification and identification of phloridzin from litchi peel
　　XIE Yang1,LAI Wei1,WAN Miao-jian1,XIE Xiao-yuan1,CHEN Li2
　　(1.Department of Dermatology, the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510630, Guangdong China; 2.P&G (China) Co.Ltd, Beijing 100000)
　　
　　Abstract： ObjectiveTo extract phloridzin, a skin-whitening agent and antioxidant, from litchi peel, and identify the structure after purification.MethodsFresh litchi peel was air-dried, extracted with 70% ethanol solvent in ultrasonic wave. The extract was then purified with D101 macroporous resin adsorption chromatography, C18 solid phase extraction and high performance liquid chromatography (HPLC). And the component purified was identified by mass spectrography (MS).ResultsCompared with the phloridzin standard, the MS curves of the component coincided with those of phloridzin standard.ConclusionLitchi peel contains phloridzin, which can be extracted with 70% ethanol solvent diffusion in ultrasonic wave.
　　Key words: litchi peel；phloridzin；extraction；purification；identification
　　
　　根皮素及其糖苷(见图1)属于黄酮类中的二氢查耳酮，是国内外新近研究开发的一种新型皮肤美白剂和抗氧化剂。二氢查耳酮被称为植物中的少数黄酮，在自然界分布较少，其中根皮素及根皮苷主要存在于苹果、梨等植物的根茎和根皮中，因而得名，据文献报道其多以糖苷的形式存在[1-2]。荔枝(Litchi chinensis Sonn)是中国岭南地区盛产的特色水果，既往对荔枝果皮的研究发现，荔枝皮提取物有很强的抗氧化活性，并初步推断其抗氧化成分中含有黄酮类物质[3]。如能从荔枝果皮中提取和分离根皮苷，作为一种具有美白和抗衰老活性的天然原料应用于化妆品中，不仅来源广泛，而且变废为宝，可以带来巨大的社会经济效益。目前尚没有从荔枝中发现根皮苷的文献报道，本文尝试从荔枝果皮中提取根皮苷，并作纯化和鉴定。
　　
　　1实验部分
　　
　　1.1主要仪器、试剂和材料：Agilent 1100高效液相色谱仪（光电二极管阵列检测器）、Ultimate C18柱（250mm×4.6mm，5μm），Dikma C18固相萃取小柱（500mg，3ml）。
　　API 4000 QTrap 液相色谱－三重四极杆/线性离子质谱联用仪（美国应用生物系统公司），数据自动关联－增强子离子扫描，锁定435.4 m/z，碰撞能量－15V、－30V、－45V三者叠加，扫描范围50～500m/z。
　　
　　KQ5200DA型数控超声波清洗器，功率100W。
　　HGC-12氮吹仪(天津恒奥公司)，温度50 ℃。
　　D101大孔树脂（天津南开和成公司）。
　　根皮苷标准品购自美国Sigma公司，纯度≥99.0%。
　　流动相所用甲醇为色谱纯（Dikma公司），实验用水为去离子水。其余试剂均为分析纯。荔枝品种为桂味，采自广州增城船坑果园。
　　1.2 高效液相色谱条件：流动相A为甲醇，流动相B为0.1%乙酸（v:v，pH3.20），进样量20μl，柱温35 ℃，检测波长286 nm。流动相梯度及流速见表1。
　　1.3 样品处理：精密称取根皮苷标准品0.0050g，溶于甲醇中，配制浓度0.002mg/ml和0.005mg/ml的标准品溶液，4℃避光保存。
　　新鲜荔枝果皮（连衣）阴干后，粉碎过40目筛。准确称取荔枝皮粉末10.0g，加入70%乙醇150ml，超声处理30min，功率100%。过滤后重复提取一次，合并滤液。滤液经旋转蒸发仪减压浓缩至70ml，加入180ml无水乙醇静置，16h后以滤纸过滤。滤液减压浓缩至醇全部挥发，加入纯水150ml超声辅助溶解，过滤后得到粗提液。
　　粗提液上样至经处理的大孔树脂柱16g，上样速度1 ml/min。然后以纯水淋洗至无色（共450ml纯水）。再以70%乙醇50ml解吸附，流速1ml/min，得到荔枝皮提取液，予4℃避光保存。
　　1.4 固相萃取：取荔枝皮提取液5ml以1ml/min流速通过活化后的固相萃取小柱（活化固相萃取小柱先用10ml甲醇通过小柱，再以10ml纯水洗去甲醇，速度均为1ml/min），前3ml流出液弃去，余流出液收集。
　　1.5 纯化：将固相萃取后流出液用氮吹仪浓缩至120μl，经0.45μm微孔滤膜过滤后作高效液相色谱，收集相应保留时间流出的组分，得到纯化后的单体化合物。
　　1.6 结构鉴定：将根皮苷标准品和荔枝果皮提取液经纯化后的单体化合物分别作高效液相色谱、质谱检测。其化学结构见图1。
　　
　　2结果
　　
　　2.1 高效液相色谱结果：根皮苷标准品保留时间为21.444 min（图2），荔枝果皮提取液在相同保留时间可见色谱峰（图3），纯化后的单体化合物保留时间与标准品基本一致（图4）。
　　2.2 质谱结果：根皮苷标准品主要质谱峰（图5）和荔枝果皮提取液纯化后的单体化合物主要质谱峰（图6）一致。
　　
　　3讨论
　　
　　根皮苷作为一种国际上日益重视的新型美白剂，其美白机制是它的水解产物根皮素能竞争性抑制皮肤黑色素细胞中的酪氨酸酶活性，从而干扰黑色素的合成，并且其抑制率优于目前许多美白产品中使用的熊果苷和曲酸[4]。研究结果显示，小鼠黑素瘤B16细胞和人上皮黑素细胞培养基中加入根皮素后，其酪氨酸酶活性、酪氨酸酶水平、酪氨酸酶相关蛋白-1、酪氨酸酶相关蛋白-2以及黑色素含量都较对照组低[5]。
　　根皮苷是水溶性的黄酮类物质，极易溶于中浓度的醇溶液中，因此本实验采用70%乙醇浸泡和超声辅助法作初步的提取。但是粗提液中含有大量的杂质，往往影响结果的判断，必须进行净化处理后才能有效判断粗提液中是否含有根皮苷。
　　
　　大孔树脂是近十年来发展起来的一类有机高分子聚合物吸附剂，它的吸附作用与表面吸附、表面电性或形成氢键等有关。由于具有吸附快、解吸快、吸附容量大、易于再生、使用寿命长等优点，大孔树脂近年被广泛用于天然物质，尤其是多酚类物质的分离。Dong[6]从多穗柯甜茶中提取根皮苷，以大孔树脂初步分离，得到了较好的富集效果。本实验中，经过大孔树脂吸附层析处理后，可以有效去除醇提液中大量的糖类、无机盐、黏液等物质，初步净化和富集粗提液。
　　荔枝皮中除含有黄酮类物质外，还含有油脂类物质、蜡质、色素等弱极性物质，这些杂质不仅影响黄酮类物质的检测，并在C18柱上残留积累，降低柱效，因此样品分析前需作脱脂处理。一般应用正己烷、石油醚等非极性有机溶剂进行脱脂，但是存在着操作复杂、还会在一定程度上造成黄酮类物质损失的缺点，影响分析结果[7]。所以本实验用固相萃取的方法代替，将黄酮类物质和其他杂质通过固相萃取小柱分离，从而简便快速地达到净化提取液的目的。
　　高效液相色谱（HPLC）是采用高压下液体为流动相、高效能微粒为固定相以及高灵敏度检测器的柱色谱技术。高效液相色谱能够分析样品，提供紫外波谱扫描，初步鉴定物质的化学结构，并且对复杂的样品具有强大的分离能力，具有灵敏度高、分析时间短的优点。本实验中根皮苷标准品的保留时间为21.444 min，经过净化的提取液在21.518 min处可见色谱峰，保留时间与标准品基本一致，因此初步判断该色谱峰物质为根皮苷，并可对其进行纯化。
　　质谱（MS）法是通过被测样品离子的质荷比的测定来进行化合物结构分析的技术，它能够提供可靠、精确的相对分子量信息和结构信息，具有高选择性和高灵敏度，有研究显示，其最低检测限可低于1ng/ml[8]。本实验中，纯化后的单体化合物其主要的质谱峰与根皮苷标准品基本一致，说明该单体化合物为根皮苷。
　　本文研究结果显示，荔枝果皮中含有美白剂根皮苷，并且采用上述方法能成功分离、纯化根皮苷，为以后的大批量生产以及对其生物学作用的进一步研究打下来基础。
　　
　　[参考文献]
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　　[2]Pohl C, Will F, Dietrich H, et al. Cytochrome P450 1A1 expression and activity in Caco-2 cells:modulation by apple juice extract and certain apple polyphenols[J]. J Agric Food Chem, 2006, 54(26):10262-10268.
　　[3]郑公铭,义志忠,张际标,等. 荔枝果皮抗氧化作用研究[J].天然产物研究与开发 2003，1115 (14):341-344.
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　　[5]Lin YP, Hsu FL, Chen CS, et al. Constituents from the formosan apple reduce tyrosinase activity in human epidermal melanocytes[J]. Phytochemistry, 2007,68(8):1189-1199.
　　[6]Dong H, Ning Z, Yu L,et al. Preparative separation and identification of the flavonoid phlorhizin from the crude extract of Lithocarpus polystachyus Rehd[J]. Molecules, 2007,12(3):552-562.
　　[7]杨亚玲,赵红芳,苏 毅,等. 固相萃取和高效液相色谱法测定甜茶中的黄酮类物质[J].食品科学, 2006,27（9）：197-199.
　　[8]Bagheri H, Babanezhad E, Khalilian F．A novel sol-gel-based amino-functionalized fiber for headspace solid-phase microextraction of phenol and chlorophenols from environmental samples[J]. Anal Chim Acta, 2008,616(1):49-55.
　　
　　[收稿日期]2008-04-15[修回日期]2008-07-08
　　编辑/张惠娟