[富含血小板血浆双相接种法构建组织工程骨] 富血小板血浆

　　[摘要]目的：传统的细胞接种法接种效率低，影响组织工程骨的成骨质量。本研究预探讨富含血小板血浆双相接种法是否可以提高细胞接种效率、优化组织工程骨的构建。方法：分别用富含血小板血浆、乏血小板血浆重悬BMSCs，灌注于三维多孔PLGA支架中，凝血酶促凝，体外培养。通过扫描电镜观察支架表面的细胞分布；通过检测支架内DNA含量、ALP含量、成骨基因表达情况分析细胞的接种效率、增殖和分化情况，并与传统的接种方法进行比较。结果：富含血小板血浆和乏血小板血浆双相接种法均能提高细胞与三维支架的结合效率；富含血小板血浆还可以促进支架内细胞的增殖，同时不影响细胞的分化。结论：双相接种法可以提高细胞的接种效率；与普通双相接种法相比，富含血小板血浆双相接种法可以进一步优化组织工程骨的构建。
　　[关键词]富含血小板血浆；细胞接种；骨组织工程
　　[中图分类号]R318[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2011）03-0402-06
　　
　　Constructing tissue engineering bone by a biphasic seeding strategy with platelet-rich plasma
　　LEI Hua,XIAO Ran,CAO Rui,LV Xiao-yan,GUI Lai
　　(The Sixth Department,Plastic Surgery Hospital,Peking Union Medical College, China Academy of Medical Sciences,Peking,Beijing 100144,China)
　　
　　Abstract:ObjectiveThe conventional static seeding is not efficient in constructing tissue engineering bone, which impacts the quality of osteogenesis. This study wants to prove if a biphasic seeding strategy with platelet-rich plasma (PRP) can improve the conventional static seeding.MethodsThe BMSCs suspension in PRP or platelet-poor plasma （PPP） was infiltrated in 3D PLGA scaffolds, clotted by thrombin and cultured for different days. The cell seeding efficiency was evaluated by SEM and by measuring initial DNA contents in 3D scaffolds. The cell proliferation was evaluated by measuring DNA contents in 3D scaffolds in different culture days.The cell differentiation was evaluated by measuring ALP contents and osteogenesis gene expression in 3D scaffolds.Results PRP and PPP could improve the integration of cells and 3D scaffolds. PRP also could enhance the cell proliferation and did not impact the cell differentiation in 3D scaffolds.ConclusionThe biphasic seeding strategy can improve the cell seeding efficiency. PRP can optimize the constructing of tissue engineering bone.
　　Key words: platelet-rich plasma (PRP);cell seeding;bone tissue engineering
　　
　　骨组织工程学中，细胞与三位支架的结合即细胞接种是非常重要的一步，目前常用的细胞接种方法仍是静置接种法，即细胞悬液直接滴加在支架表面。此方法适用于各种细胞和支架，但效率低，不仅细胞流失多，细胞也不易均匀布于支架内部[1-2]。因此，有很多研究探讨如何将细胞高效且均匀地分布于支架内。其中有学者将细胞重悬于纤维蛋白原[3-6]或胶原[7-13]的溶液中，将此溶液灌注于支架中，再用促凝剂使溶液凝成凝胶，固定细胞于支架内--即双相接种法。研究表明此方法不仅使细胞与支架的结合效率提高，而且细胞可以灌注于支架内部，有利于细胞的均匀分布。
　　本研究试用富含血小板血浆（platelet-rich plasma， PRP）替代纤维蛋白原和胶原作为双相接种媒介改进细胞接种方法。因为PRP（内含丰富自体纤维蛋白原）不仅具有与纤维蛋白原一样的双相性，更重要的是它含有大量血小板，血小板在促凝剂激活时释放大量活性蛋白，其中包括多种生长因子。所以理论上用PRP接种细胞时可以向支架中输送生长因子和其他活性蛋白，这样不仅可以机械性地将细胞固定于支架中，还可以进一步促进细胞的粘附、增殖、分化等生物事件。为证实我们的设想，本实验用传统静置接种法、乏血小板血浆（platelet-poor plasma，PPP）和PRP双相接种法构建细胞支架复合物，比较三种方法的接种效率，观察细胞在支架内的增殖和分化情况。
　　
　　1材料和方法
　　1.1 山羊骨髓抽取：中国青山羊一只，5月，10kg。速眠新（长春军事医学科学院）1.5ml肌肉注射麻醉。18号骨髓穿刺针于髂后上嵴抽取5ml骨髓。
　　1.2BMSCs原代培养及传代：人淋巴细胞分离液（Boster，武汉）密度梯度离心分层骨髓，取中层有核细胞层至25cm2培养瓶中（Corning, Germany），加入基础培养基4ml，主要成分高糖DMEM（Hyclone，USA），10% FBS（Hyclone，USA），100U/ml 青霉素（Sigma，China），100mg/ml链霉素（Sigma，China）。37℃，5% CO2，孵育4天首次换液，随后3天换一次液。待细胞90%融合，0.25%胰酶消化细胞、收集、重悬，以5 000/cm2的密度接种于75cm2培养瓶中传代，每3天换液一次。第三代细胞用于以下实验。
　　1.3 BMSCs成骨诱导培养及鉴定：诱导培养基的成分为：DMEM（Hyclone，USA），10% FBS（Hyclone， USA），100U/ml 青霉素（Sigma，China），100mg/ml 链霉素（Sigma，China），0.1μM 地塞米松（Sigma，USA）, 10mM β-磷酸甘油酯（Sigma，USA） and 0.17mM 维生素C（Sigma，USA）。将第三代细胞以1 000/cm2的密度接种于35mm的培养皿中（Corning, Germany），加入基础培养基孵育24h，换液，加入诱导培养基向成骨细胞诱导培养。每3天换液一次。
　　诱导7天后，用CAKP试剂盒（中国南京建成生物工程研究所）进行ALP染色。成骨细胞胞质中可见红或棕色ALP阳性颗粒。诱导14天后，用茜素红（中国阿拉丁试剂有限公司）进行钙结节染色。钙化结节呈现不同的红色。
　　1.4 PRP和PPP的制备：中国青山羊一只，5月，10kg。速眠新1.5ml肌肉注射麻醉。50ml注射器内含5mlACD（0.48g柠檬酸，1.32g柠檬酸钠，1.47g葡萄糖溶于100ml双蒸水），于颈静脉抽取全血40ml，离心1 000g，15min，取上层血浆二次离心，3 000g，20min。上层为清亮的PPP，移入另一5ml离心管中备用。中间层为白色的血小板团轻用吸管吸出移至另一离心管中。用少量PPP将血小板团重悬，人工血小板计数，调节成浓度为106/μl 的PRP备用[14-16]。PPP中血小板浓度104/μl。
　　1.5 PLGA支架预处理：PLGA支架由济南岱罡生物科技有限公司提供。PLA:PGA=75:25。孔径大小100～300μm，空隙率80%。将大块PLGA切成5mm×5mm×3mm小立方体，供体外研究使用。PLGA立方体浸泡于75%酒精中消毒24h，PBS漂洗3次，DMEM孵育30min，取出至于无菌纱布上，吸干大部分水分。
　　1.6 三种接种方法构建细胞/支架复合体：方法一，为传统静置接种法，即DMEM重悬细胞，调节细胞密度至5×106/ml。滴加80μl细胞悬液/支架，37℃，5% CO2，孵育2h，移入六孔板，每孔5ml诱导培养基。方法二，PPP重悬细胞，调节细胞密度至5×106/ml。滴加80μl细胞悬液/支架，随即滴加30μl凝血酶溶液（10 000IU凝血酶（Sigma，USA）加入10%CaCl2（Sigma，China）中），加盖，37℃，5% CO2，孵育30min，移入六孔板，每孔5ml诱导培养基。方法三，PRP重悬细胞，其余同方法二。每3天换一次液。接种后24h 倒置显微镜下观察。
　　1.7 细胞/支架复合体电镜扫描：细胞/支架复合体培养3天、7天后，2.5%戊二醛固定，30%～100%的梯度乙醇脱水，真空干燥，表面喷金处理后在扫描电镜下观察照相。
　　1.8 细胞/支架复合体DNA定量分析：分别于1天、5天、9天、14天每组取4个细胞/支架复合体，PBS漂洗两次，放入7ml离心管中，剪成小块，加1ml骨细胞消化液[11,13]，37℃水浴2h。将消化混合液吸入另一个7ml离心管，超声细胞破碎机处理5次,6s/次,共30s，离心200g，5min，取上清液待用。
　　上清液40μl置于96孔黑色不透光酶标板内，每个样本两个副孔，每孔加160μl Hoechst 33258（Sigma，USA）测试液（1μg/ml），放入荧光酶标仪样品槽，震荡混匀30s，选择激发波长360nm，发射波长460nm，测定样品的荧光强度。以小牛胸腺DNA（Sigma USA）做标准曲线。实验重复3次。
　　1.9 细胞/支架复合体ALP活性定量分析：取方法8中的上清液，用碱性磷酸酶试剂盒（中国南京建成生物工程研究所）测定ALP活性。50μl上清液加500μl缓冲液、500μl基质液，充分混合，37℃水浴3h。分光光度计520nm测定吸光度。吸光度的OD值代表复合体的ALP活性。实验重复3次。
　　1.10 细胞/支架复合体成骨基因相对定量分析：每个复合体置入2ml Eppendorf 管中，加入1mlTrizol（Invitrogen，USA）,剪碎复合体, 4℃放置1h,待复合体完全溶解于Trizol，提取总RNA。根据反转录试剂盒(ABI,USA)提供的实验步骤，反转录合成cDNA。各引物均由北京基莱生物科技有限公司合成。实时定量PCR反应体系为25μl，ABI7900HT定量PCR仪(ABI,USA)的反应程序：50℃ 2min→95℃ 10min →(95℃ 15s → 60℃ 1min)×40个循环→95℃ 15s→ 60℃ 1min→95℃ 15s---20℃终止反应。管家基因GAPDH作为内对照，每个样本设置3个复孔。管家基因和目的基因的引物核苷酸序列，产物大小，退火温度总结于表1。 对于每一个样本CT 值是PCR产物达到可探测的荧光强度时复制循环次数。用2-△△CT方法计算每个目的基因每个时间点的现对表达水平。对于每一个目的基因，△△CT=(CT,目的基因-CT,管家基因)Time x-标准△CT，标准△CT为DMEM组(CT,目的基因t-CT,管家基因)Time 0[17]。
　　1.11 每个数值以平均值±标准差表示，组间比较用单因素方差分析（one-way ANOVA）及Tukey"s test。设P0.05）。PRP组中的BMSCs显示了同样的趋势。但PRP组中的BMSCs自接种后1～14天，一直显著增殖（P0.05），5～9天快速上升（P0.05），14天时两组达同一水平。数据如图5所示。
　　2.5. MSCs/PLGA复合体成骨基因相对定量比较：如图6。①图6A：1天和5天，3组的ALP表达无显著差异（P>0.05），9天时PRP组显著高于其他两组（P0.05）；②图6B：1天，5天，9天 DMEM组的CollagenⅠ基因表达高于其他两组，但只有5天时有显著差异（P0.05）；③图6C：1天时，PPP组显著高于其他两组（P0.05）。9天时，3组之间无显著差异。14天时，PRP组显著高于其他两组（P 　　总的趋势是，PRP组的成骨性基因表达在培养早期明显低于其他两组，但随着培养时间延长，PRP组的基因表达逐渐上调，14天时都达到最高水平。
　　
　　3讨论
　　骨组织工程研究中，三维多孔支架已经广泛用于构建组织工程骨[18-19]。但是，细胞与支架的复合效率却不令人满意[2,20-27]，而且有研究显示，体内的成骨只发生在支架的周边，在多孔支架的中心无骨组织形成[20,28-29]。这可能是由于在细胞接种时，细胞不能进入支架的内部[20]，而且随着细胞的粘附和扩增进一步阻碍了细胞向支架内部移动[26]。可见，细胞接种是构建细胞/支架复合体的关键，直接影响骨再生的质量。因此，很多学者研究了有利于细胞均匀分布于三维多孔支架内的接种方法，例如低压接种系统[20]，生物反应器灌注系统[2,21]，旋转烧瓶接种法[7]，离心接种法[25,27]，及表面声波技术[26]。这些接种技术均表现出良好效果，但是有些需要特殊设备不利于普及推广，有些步骤繁琐、耗时长增加了污染的机会。与这些技术相比，由纤维蛋白原和胶原介导的双相接种法简单、经济、方便、适用于各种细胞和支架。它也属于静置接种法，但是与传统静置接种法不同的是，通过纤维蛋白原和胶原的变相功能可以把细胞固定在支架中，而且有研究表明此方法可以使细胞均匀分布支架中[3,7-13]。
　　另一方面，随着三维支架孔径增大孔隙率提高，支架表面积与体积的比值必然下降，所以致使只有与孔壁接触的细胞能够粘附于孔壁表面，而那些悬在孔中的细胞则会被培养基冲洗掉或沉淀至支架底部[7]。纤维蛋白原和胶原作为细胞接种媒介可以通过凝成凝胶将悬在孔中的细胞包埋固定在支架内，从而提高细胞接种效率[3,7-10]。但是，其他接种方法没有这个功能，因此，我们认为由纤维蛋白原和胶原介导的双相接种法是值得推广和进一步研究的。
　　本研究用PRP代替纤维蛋白原和胶原作为双相接种媒介输送细胞至支架内,目的在于进一步改进双相接种法。
　　结果显示，PRP和PPP (自体纤维蛋白原) 都可以将BMSCs 全部复合在支架中，几乎没有细胞散落；扫描电镜也显示PRP和PPP组复合体表面粘附大量细胞；在细胞接种后24h，PPP和PRP组复合体的DNA量显著高于DMEM组。这些都说明PRP与PPP一样可以通过凝胶作用显著提高细胞接种效率。但是，随着培养时间延长，PRP组BMSCs 的增殖速率显著较PPP组快，这表明PRP较PPP更能促进BMSCs的增殖。在以往的研究中，只有高浓度的PRP(2.5×108血小板/细胞支架复合体)才能有效促进细胞增殖，低浓度的PRP(0.625×108 and 0.16×108血小板/细胞支架复合体)没有明显效应[30]。但是，我们的研究中，PRP的浓度是0.8×108血小板/细胞支架复合体，仍然显示明显的促BMSCs增殖作用。这可能是因为血小板和细胞一样充填并被固定在孔隙中，当血小板被凝血酶激活后，释放生长因子等大量活性蛋白，通过类似旁分泌的作用方式作用于周边的BMSCs，所以，尽管PRP的浓度不高，但作用很强。而以往的研究，只是将PRP凝集在细胞支架复合物的表面，血小板释放的活性蛋白不容易渗入支架内部发挥作用，所以只有通过提高PRP浓度才能表现出明显的生物学效应[30]。
　　有实验显示经高浓度PRP做用的BMSCs，其ALP活性下降，因此认为PRP抑制BMSCs的成骨分化[30-31]。本实验结果显示，在培养早期（5天内），PRP组ALP活性与其他两组无明显差异，可这个时期PRP组的BMSCs数量却明显较其他两组多，这似乎表明BMSCs的成骨分化被抑制。但是随着培养时间延长，PRP组ALP活性迅速上升，到9天、14天已经显著高于其他两组。因此，我们认为并不是PRP抑制了BMSCs的成骨分化，而是由于PRP的促细胞增殖作用使PRP组中的BMSCs在培养早期大多数处于有丝分裂状态或刚刚完成分裂，也就是处于未分化状态，当BMSCs完成增殖，开始发育成熟转变为成骨细胞，ALP活性也随之增加。Arpornmaeklong等的研究也表明经高浓度的PRP作用的细胞支架复合体，细胞ALP活性在15天后开始增高[30]。
　　为了进一步明确PRP对BMSCs成骨分化的影响，我们对细胞支架复合体中成骨性基因ALP、 CollagenⅠ、Osteonectin的表达进行相对定量分析。结果显示，在细胞支架复合体培养早期，PRP组3个成骨基因的表达较其他两组低，但是随着培养时间延长，表达迅速上调， ALP在9天时达各组最高水平， CollagenⅠ和Osteonectin 14天时达到3各组最高水平。此结果与ALP活性分析结果相符，这说明PRP并不是抑制了BMSCs的成骨性分化，而是因为培养早期，BMSCs处于增殖状态，当其完成增殖时必然会向成骨方向分化，也就是说，PRP不是抑制了BMSCs的分化，而是由于促进细胞增殖的原因而使分化推迟了。
　　PRP已经被广泛应用于临床及实验研究，除了与BMSCs或自体松质骨颗粒混合可以促进骨组织再生外[14,32-34]，它还可以用于像面颈部除皱、乳房缩小或增大等美容整形手术，以减少术后血肿、血清肿、瘀斑、肿胀[36-37]。PRP还被用于置入牙种植体或人工骨移植物周围以提高和加速骨整合[16,38]。但据我们查阅的大量文献，至今没有研究将PRP用于细胞接种，我们首次提出PRP双相接种法，经实验检测，效果良好。
　　从本实验方法可以看出，PRP双相接种法是一个很实用的接种方法。PRP可以由自体全血经两步离心获得，无毒、无免疫源性，因此说此方法既安全又经济。如果与其他方法结合，如低压接种法、离心接种法，可能会更有效地输送细胞至三维多孔支架内。此方法也适用于其他细胞系的接种，用于其他组织的组织工程学研究，如脂肪、软骨。
　　
　　4结论
　　本研究结果显示：以富含血小板血浆(PRP) 为媒介的双相接种法，不仅可以大大提高BMSCs接种于三维多孔PLGA支架的效率，还可以促进BMSCs在支架中的增殖，同时不抑制其成骨性分化。这些结果说明PRP双相接种法在组织工程骨构建中具有实际应用价值，为组织工程骨的临床应用奠定一定基础。
　　
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　　[收稿日期]2010-11-23 [修回日期]2011-01-19
　　编辑/张惠娟