血管组织工程的进展:血管组织工程

　　Vascular tissue engineering 　　 　　血管病变尤其是冠状动脉的闭塞性病变为人类的主要病死原因之一。其主要的治疗方法是血管搭桥手术,需要各种直径的血管移植物作为修补材料。临床已经应用的血管移植物包括自体血管、异体血管和合成材料管道。然而目前无论那种血管移植物都无法满足临床需要，临床需要一种新的血管替代物，这种管道应具有高度的组织相容性、可生长性及外科易操作性，且应无排异反应、无血栓形成、不易感染等优势,移植后能维持管腔的长期通畅,从而提高血管移植手术的长期疗效。组织工程学的出现为这种血管移植物的研发提供了可能。但血管的组织工程研究仍面临着巨大的挑战：良好的血管替代物要求有足够的强度以免在血压变化时出现破裂；要有弹性来承受循环负荷；要与临近的自体血管有良好的愈合性能；还要有完整健康的内膜层，以防止血栓的形成。目前很多组织工程化的组织，例如骨、软骨等的构建过程依赖于在受体体内随时间推移而逐渐达到组织重塑并最终获得功能，而组织工程化的血管必须在移植的同时就具有完全的结构和功能。这就要求在体外培养出具有生命力和良好性能的血管替代物，因此血管组织工程研究难度大大增加。本文就血管组织工程的进展综述如下：
　　
　　1组织工程血管移植物研究的历史
　　
　　实际上，在组织工程概念提出以前，心脏外科和血管外科的临床医生及很多研究人员就已应用某些类似今天组织工程所使用的方法来获得更好的血管替代物。从血管组织工程的发展来看，可以分为以下几个方面：
　　1.1非降解合成材料表面的内皮化:非降解合成材料人工血管研制成功，使其在大、中动脉代用方面取得较好的效果，但在小口径动脉（ 　　2.2种子细胞的功能调控:在进行细胞培养及组织构建的过程中，如何保持细胞的功能，防止其在体外增殖过程中出现退化，对于获得与自体血管相近的血管代用物是十分重要的。在血管的构建中主要是平滑肌细胞功能的调控，因为血管的强度主要依靠中膜层。而要想维持良好的强度，就必须保证在支架材料降解以前平滑肌细胞有合适的密度并产生足够量的细胞外基质。因而如何促进平滑肌细胞外基质的分泌就成为研究的重点。目前研究显示，TGF-β1 能明显促进平滑肌细胞的胶原表达[14]，而且还发现其具有抑制细胞增殖的作用，从而可以防止因平滑肌细胞过度增生导致的管腔狭窄[15]。种子细胞的功能调控目前仍处于初步阶段，很多机制还没有弄清楚，需要进一步的研究和探索，希望能够找到促进细胞快速增殖同时又能保持良好功能的方法。
　　
　　3生物可降解支架的研制和改性
　　
　　在组织工程血管代用物的构建中，涉及很多因素。其中重要的一个就是支架的选择，可以肯定地讲，材料上的突破将会给组织工程带来革命性的发展。
　　3.1天然支架材料：构建组织工程血管常采用的天然材料包括胶原蛋白和弹性蛋白等，以及目前研究较多的血管脱细胞基质材料。它们含有特殊氨基酸序列精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）。RGD是一种可被细胞膜上的整合素受体识别的配体，有利于促进细胞粘附。
　　3.1.1胶原材料：1986年，Weinberg等[16]首先建立了以动物胶原蛋白和血管细胞培养构建的血管模型。这种材料在较低的静脉压力下就发生破裂，它的强度远远不能达到植入体内的要求。为了获得强度更好的支架材料，人们把小肠粘膜下层（SIS）分离出来并进行化学处理去掉细胞成分，仅留下主要为胶原的细胞外基质。这种材料的力学强度明显增加，基本能够满足组织工程的要求。Huynh等[17]研制了一种SIS管状支架，在保持支架材料生物相容性的前提下，应用最少的化学交联将其同胶原层结合在一起来提供机械强度。血管移植物的内表面用肝素处理防止血栓的形成，然后植入到兔体内，13周内所有的移植物均通畅，并且可以看到平滑肌细胞和内皮细胞从周围长入移植物内，此外这种移植物的缝合性能完全能满足移植需要。当移植物从体内取出并给予一定的化学刺激时可以出现功能性的反应。研究发现SIS的力学强度及移植后的效果明显好于静脉移植，但在进行降主动脉移植后6个月会出现扩张，考虑与弹性纤维合成不足有关[18-19]。羊膜也被认为是进行血管组织工程研究的一种比较理想的支架材料[20]。
　　3.1.2血管脱细胞基质材料:将异种的血管脱细胞基质材料应用到组织工程血管的构建中一直是研究的热点。Teebken等[21]制备了猪的血管脱细胞基质材料，并将来自人大隐静脉的内皮细胞和成纤维细胞种植在脱细胞基质材料上，在体外灌注的条件下获得单层内皮细胞。这种材料提供了良好的细胞外基质并且不会产生免疫反应和炎症。Schaner 等[22]则用SDS（十二烷基磺酸钠）将人的大隐静脉脱细胞，静脉内的细胞去除达到94%以上，胶原及基底膜的结构保持完好，其力学强度也可满足血管移植的需要。
　　血管脱细胞基质材料具有较好的生物相容性和力学强度，但往往因为纤维化的出现而导致失败。而来自动物的脱细胞基质有可能传播疾病以及人体对外来物质的免疫反应都是有待解决的问题。
　　3.2合成的生物降解材料：生物可降解的多聚体材料被设计成一个过渡的环境，它给将要形成的组织提供支持，它的降解速率与新组织的生成速率接近以便及时给细胞的生长和基质的形成提供空间。多聚体材料为组织的生长提供三维的框架，保证了生成组织的结构和机械特性[23-24]。聚乙二醇酸（PGA）已被证实具有良好的生物相容性，在多种组织工程中被广泛地应用。1999年，Niklason等[25]第一次成功地证实合成的PGA材料在血管组织工程中的应用是可行的。他们将牛动脉平滑肌细胞种植在PGA支架上，在脉动流的生物反应器条件下体外培养8周， PGA大部分降解，成功构建了一条对药物刺激有收缩反应的血管。为了获得更好的血管支架材料，人们将PHA与PGA共聚结合做成支架，也获得了良好的性能，在力学强度及生物学特性上更接近自体血管[26]。
　　3.3合成材料的改性：为了获得更好的生物相容性，人们对合成材料进行了各种预处理及改性，以期能提高生物相容性。研究者们从材料学、物理学、化学、生物化学及医学角度对这一问题进行了深入的研究，目前研究主要集中于应用一些细胞外基质（ECM）蛋白，如胶原、纤维粘连蛋白、层粘连蛋白等以及血清预处理PGA支架，结果显示改性后能明显提高细胞的粘附率[27-28]。Ratner等[29]认为材料的表面修饰应能做到不改变材料的机械特性与功能性，并且材料的生物相容性、生物可识别性或生物功能性均得到增强。通过在表面引进位点固定生物分子或识别配基，可阻止细胞与材料之间非特异性相互作用和生物分子吸附。
　　随着研究的深入，研究者们发现细胞与细胞外基质蛋白作用的过程其实质是细胞膜上整合素受体与细胞外基质蛋白中配体特异性结合的过程，正是这种特异性的结合实现了跨膜信号传递，从而促使细胞发生一系列的生理生化反应，并与材料发生粘附。在整合素上最常见的配体位点为精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp,RGD）序列，因此在组织工程血管材料表面共价结合（而非表面简单涂附）RGD三肽或含有RGD序列的蛋白或多肽，与内皮细胞发生配体和受体的特异性结合应是促进粘附的较好方案之一。RGD有助于细胞粘附分化和增殖的作用目前已经得到公认，多个实验也证实在不同的载体材料上结合RGD后均能明显增加细胞的贴附率[30-31]。
　　3.4两种材料的联合应用:可降解合成材料的预处理和改性使其具备了与天然材料类似的生物相容性，同时保留了合成材料良好的机械力学特性。但改性的过程非常复杂并且有可能带来感染，改性应用的细胞外基质可能会带来免疫反应，在合成材料上细胞的生长速度远远低于在天然材料上的生长速度，这些都制约它的应用。为了解决这一问题，人们把天然材料和人工合成材料结合起来，这样就可以扬长避短，获得理想的血管支架。Furukawa等[32]首先进行了尝试，他们用聚乙醇酸（PLLA）做成多孔的支架，然后将平滑肌细胞和胶原溶液混合后种植于支架的孔隙内进行培养，结果显示平滑肌细胞与载体的结合效率接近100%，明显高于常规培养。Iwai等[33]将Poly(lactic-co-glycolic acid)与胶原海绵混合做成血管补片用来修补犬的肺动脉，比较了进行自体血管细胞接种与未行自体血管细胞接种两组的情况。结果显示6个月时两组均无血栓形成，并且都形成了完整的单层内皮和类似自体血管壁的组织结构。说明两种材料联合应用可以达到预期的效果。
　　
　　4生物反应器的设计和组织培养的调控
　　
　　无论以何种方式培养细胞,如果不是以人工诱变为目的,其最根本的要求就是尽量在体外模拟该种细胞在生物体体内的生长环境。而生长环境的某些偏差,如生长信号、化学信号、应力信号的阻断,要么导致细胞凋亡,要么导致细胞正常形态或生理功能的丧失。同时，临床上对组织工程化产品及治疗的需求促使人们要研制出能精确调控并能大规模生产高质量组织替代物的设备。因此，生物反应器及其相应技术被开发研制并应用到组织工程当中来。
　　人们为了培养出接近自体血管的组织，依据体内环境设计了很多种生物反应器。Kim BS[34]较早提出了动态培养的概念,即在旋转或振荡条件下种植培养平滑肌细胞。与静态种植比较,前者细胞附着的数量、分布的均匀度、生长情况和纤维蛋白的沉积都优于后者。
　　在血管细胞种植培养时还应考虑到血管在体内要受到血液动力学的影响,包括切变应力、牵拉应力和正应力,这对细胞生长及功能发挥均有重要作用。Conklin 等[35]设计了一种简单的用于组织工程血管构建的脉动灌注的生物反应器。它由凸轮驱动的注射器和蠕动泵以及多个腔室组成，它的压力维持在60～200mmHg，且不会影响到流动的速度、流动波幅及压力的波幅。用这个带脉动灌注的生物反应器培养猪的颈总动脉，结果检测平滑肌细胞和内皮细胞均有良好的功能。Williams 等[36-37]在生物反应器灌注条件下将平滑肌细胞种植于非编织的PGA材料上13天后再种植内皮细胞，48h后可获得完整连续的单层内皮细胞层。并且在整个培养期间平滑肌细胞持续分泌胶原和弹性蛋白。在其后续实验中进一步证实随培养时间的延长可以获得较理想的功能性血管替代物。但以上实验的血管构建所需时间长，长期的体外培养使得血管构建的成功率极低，根本无法进入到临床应用阶段。Hoerstrup[38]专门设计了一个培养小口径血管移植物的生物反应器，应用PGA/P4HB 合成材料作为血管支架，将血管成肌纤维细胞和内皮细胞种植在上面，通过4天的静态培养后，将血管支架放在生物反应器中并在一定的流速和压力条件下培养，在这个实验中，可以同时培养4根血管。在生物反应器内采用胶原支架进行混合培养也获得了性能较好的组织工程化血管[39]。
　　尽管生物反应器的设计越来越接近体内环境，但它仍然无法完全模拟血管在体内生长的环境。由此人们设想能否将血管培养生长在体内进行，把体内作为一个天然的生物反应器，这样有望获得与自体血管完全接近的组织工程化血管。Chue等[40]进行了尝试，他们将可降解的聚羟基乙酸支架和非降解的聚丙烯网植入狗的胸腔和腹腔。3周后取出检测，在支架上可见生长了一层厚约1～1.5mm的组织，镜下可见多层的成肌纤维细胞和单层的内皮细胞，成肌纤维细胞α-肌动蛋白染色阳性。将支架去除后的组织管的抗爆破压力达到2 500mmHg，缝合张力达到11.5N。将其植入同一条狗的股动脉3～6.5个月，检测发现其内腔被覆一层内皮样细胞。他们认为大动物的胸、腹腔可以作为生物反应器来培养用于血管移植的替代物。
　　总之，生物反应器的研制开发及相应调控技术的发展是血管组织工程的基本因素，如何提高其性能并改进调控方式使其更加接近体内环境培养出接近自体血管的替代物，是需要研究人员不断努力和探索的。
　　
　　5血管组织工程的挑战及展望
　　
　　在过去的二十年中，血管组织工程领域取得了巨大的成就，但也仍然存在很多问题和挑战。什么是组织工程化血管必需的功能要求？很明显，不形成血栓是最基本的。但是否需要具有血管活性？这一直是个存在争论的问题，如果要想获得与自体血管相近的血管替代物，那么一定要有血管活性。但如果血管移植物一直保持通畅，那么血管活性就不是必需的。Deutsch 等[7]展示了用内皮细胞种植的ePTFE血管移植物保持了9年良好的通畅。另一个问题是血管的机械强度，血管替代物必需有一定的抗爆破压力来保证安全，但是否必需和自体血管一样拥有相当的粘弹性，也是一个值得推敲的问题。
　　在组织工程化血管的培养中还有很多有待解决的问题，如何防止血栓的形成和提高移植物的机械强度。另外要想达到接近自体血管的性能，绝大多数实验都需要8周的时间甚至更长，因为需要有足够的时间进行细胞扩增、细胞外基质的形成和达到一定的机械强度。这样在紧急状态下是不可能应用组织工程化血管的。而且，必须应用自体细胞来构建血管，以避免免疫排斥反应。而宿主成体细胞存在粘附和增殖较弱的问题，还有传代后细胞衰老的问题；同时组织工程化血管的构建需要多种技术的结合，费用昂贵。所有这些都成为血管组织工程发展的障碍。
　　尽管存在诸多问题，但已取得的成就还是令人鼓舞的，目前已将干细胞应用到血管组织工程当中解决种子细胞问题，并采用基因工程技术对种子细胞进行处理；同时也在进行各种新载体材料的开发研制；生物反应器的研究也越来越深入。组织工程化血管最终将成为活的组织，可以生长、塑形，对环境中的各种生物化学及物理刺激产生反应。这些血管替代物将在结构、成分、机械性能及功能上非常类似自体血管。随着对血管发生及功能中各种因素作用机制的研究越来越深入，组织工程化血管将最终应用到临床，改善那些有血管疾病患者的生活，对人类的健康做出贡献。
　　
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　　[收稿日期]2007-06-06 [修回日期]2007-08-15
　　编辑/李阳利
　　
　　注：“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。”