细胞素美白再生精华液【细胞共培养技术在美白药物研究中的应用及前景】

　　随着生活水平的提高,人们对生活质量的要求越来越高,越来越重视皮肤的自然美白。运用细胞培养技术从中药中寻找安全、有效的脱色剂已成为研究的主要方向[1-2]。目前,所用的细胞实验模型有一种细胞的单独培养、两种或两种以上细胞的共培养。单独培养一种细胞未考虑体内其他细胞对其产生的作用,而细胞共培养弥补了这方面的不足,让研究者能够使用更符合生理学特点的模型来进行一系列研究[3-5]。本文就细胞共培养技术筛选美白药物的发展现状及前景综述如下。
　　
　　1细胞共培养的方法
　　细胞共培养技术目前应用的方法可分为单层混合共培养技术、非接触式共培养技术和组织工程支架技术。单层共培养是将两种以上细胞放入同一器皿中共同培养的方法,非接触式共培养是通过Transwell小室来实现的。将Transwell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下室以聚碳酸酯膜相隔,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞,从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。组织工程支架技术是将在体外培养、扩增的正常组织细胞种植到具有良好生物相容性且在体内可逐步降解吸收的组织工程多孔支架上,使细胞在支架上增殖、分化[6]。现阶段美白药物筛选常用的是单层混合共培养技术,非接触式共培养还未见用于美白药物筛选,而组织工程支架技术中的皮肤类似物将可能成为发展方向。
　　
　　2细胞共培养技术在美白药物筛选领域的应用及发展
　　黑素合成和转运的每一个过程都有着精细的调控机制,其中任何一个环节出现结构和功能的异常,都有可能引起皮肤色素异常性改变[7-9]。黑素生成是发生于黑素细胞的细胞器黑素小体,此过程包括黑素小体的形成和在L-酪氨酸酶作用下转化成为黑素的生化途径。酪氨酸酶是这一生物合成过程的关键酶,其活性与黑素合成量密切相关,控制其活力即可控制黑素生成量。因此,可通过抑制酪氨酸酶活性和黑素生成量来筛选美白药物,黑素细胞单独培养或黑素细胞与角质形成细胞共培养将是美白中药筛选的有效途径。
　　大量学者尝试通过黑素细胞单独培养来筛选能够使黑素合成、转运受阻的美白药物。杨壮群等[1,10-12]均通过单独培养黑素细胞筛选出有些中药提取物可以抑制酪氨酸酶活性、降低黑素含量,表明单独培养黑素细胞是一种筛选美白药物行之有效的方法。但随着对皮肤构造的深入了解,研究者意识到与黑素细胞相连的角质形成细胞对其发挥的作用不容忽视,罗增香等[13]通过中药单体蛇床子素、黄芩苷对黑素合成的研究发现,共培养体系中药物对黑素合成的抑制作用强于单独培养的黑素细胞,说明了两种培养方法确实存在差别。由于细胞共培养体系更接近正常人皮肤的真实构造,得出的数据更有说服力,所以研究者便把筛选药物的方法从黑素细胞单独培养向黑素细胞和角质形成细胞共培养过度,而更接近人体皮肤结构的皮肤类似物也有希望成为美白药物筛选的新方法。
　　2.1单层混合共培养的应用:单层混合共培养是将所研究的不同种类的细胞在同一培养器皿中混合培养。它提供了类似体内的复杂微环境,包括细胞与细胞间的接触反应和细胞因子的作用。由于其操作简便,目前广泛应用于模拟人表皮微环境的实验研究。1988年,Halaban[14]首次成功地将黑素细胞和角质形成细胞共培养,验证了该模型的可行性。马慧军等[15]也成功建立了人表皮原代黑素细胞与角质形成细胞共培养的体外模型,为美白药物的筛选提供了可行的方法。仲少敏等[16]选取85种生药醇提物和水提物在 melan-a 与SP-1 共培养体系做实验研究,熊果苷作为阳性对照,结果川芎、威灵仙、桂枝、麦冬、白果、蒿本、红花、白苏叶的醇提物,五倍子的水提物在细胞培养水平对黑素生成有明显抑制作用,强于相同浓度熊果苷的作用,这一结果可为美白药物筛选提供依据。兰海龙等[17]以人包皮组织作为细胞来源,体外构建黑素细胞与角质形成细胞直接接触的混合培养模型,检测芦荟苦素、熊果苷及茶多酚作用于此模型后对黑素细胞酪氨酸酶活性以及黑素合成的影响,发现三种单体均对黑素细胞酪氨酸酶活性及黑素合成产生浓度依赖性抑制,初步阐明了美白药物的作用机理。解士海[4] 通过建立人表皮黑素细胞-角质形成细胞共培养的体外模型,研究了丹皮酚、苦参碱、氧化苦参碱、大黄素等中药单体对黑素合成过程的影响,结果表明通过观察黑素小体的转运证明了共培养模型的成功建立;熊果苷、丹皮酚、苦参碱剂量依赖性抑制共培养体系中黑素小体的转运;大黄素、氧化苦参碱对于黑素小体的转运无影响,表明丹皮酚具有很好的美白应用开发前景,大黄素及苦参碱有待进一步研究。左付国[9]建立了人的黑素细胞与角质形成细胞共培养模型,研究了熊果苷和淫羊藿苷两种中药单体对黑素小体转运的影响及其可能的作用机制,发现熊果苷可通过诱导黑素细胞树突退缩,抑制黑素小体的转运,这一研究结果为熊果苷作为美白药物提供了一项新的依据。
　　2.2皮肤类似物的应用前景:单层混合共培养模型可以对美白药物进行有效的筛选,但Tae-Jin Yoon 等[18]通过实验证明了黑素瘤细胞或黑素细胞单独培养或是与角质形成细胞共培养得到的数据与三维皮肤类似物的均有不同,而皮肤类似物更能准确地表现组织学构造,所以皮肤类似物模型,有望用于中药美白药物的大范围筛选,提高工作效率。人类正常皮肤主要以Ⅰ型和Ⅲ型胶原为主,其中Ⅰ型胶原含量最多,由于胶原分子结构中含有大量的双羧基及双氨基氨基酸和碳水化合物,适于细胞的粘附;胶原又是一种广泛存在于动物皮肤、肌腱和其他结缔组织中的天然蛋白质,来源广泛。因此,在胶原重组膜上接种人黑素细胞和角质形成细胞可以建立皮肤类似物模型。Lee等[19]利用含角质形成细胞和黑素细胞的皮肤类似物模型检测化合物光毒性,结果显示光生物学效应与天然皮肤很接近;Damour等[20]很早便指出组织工程皮肤将成为评估化妆品原料及产品皮肤刺激、光毒性、光保护等特征的有用工具,这都为皮肤类似物模型成为筛选美白中药的有效途径提供了依据。杨颖�等[21-22]分别从胎牛皮和大鼠鼠尾腱中提取胶原纤维,再经处理制成生物相容性良好的胶原作为支架,在支架材料上种植成纤维细胞构建皮肤类似物模型。杨壮群等[23-24]通过人永生化表皮细胞(HaCaT)和黑素细胞共培养体系接种在鼠尾胶原凝胶支架上构建皮肤类似物模型。张铁良等[25]将鼠尾胶原溶液、浓缩培养基、NaOH溶液和以血清重悬的成纤维细胞溶液在适当的比例下混合后形成凝胶构建真皮类似物。刘源等[26]也运用组织工程方法以包皮组织作为细胞来源构建含有黑素细胞的皮肤类似物模型。虽然以上皮肤类似物模型的建立多是用于研究皮肤缺损的修复,美白中药筛选还未有人使用这种模型,但由于皮肤类似物模型有可能与人皮肤组织融合,将使得中药美白药物筛选的数据更加可靠,筛选方法更加有效,可以作为美白药物筛选的新尝试。
　　
　　3小结
　　现今,通过细胞共培养技术筛选美白药物已成为研究的热点。细胞共培养技术经历了单层细胞的接触、非接触式共培养到三维皮肤类似物,共培养方法已日趋成熟。单层细胞共培养由于操作简单适合于实验室中药物筛选的研究,而且该模型接近真实的人体生理环境,使研究者能够更好地观察细胞与细胞、细胞与培养环境之间的相互作用以及探讨药物的作用机制和可能作用的靶点,填补了一种细胞单独培养和整体动物实验的空白[27],用此方法已筛选出了许多有效的中药提取物,有些已用于美白产品中。而三维皮肤类似物模型由于已验证了它与人类缺损皮肤的融合能力,证明了它与正常人皮肤具有良好的相似度,用该模型进行药物筛选得到的结果将更具有可信度。如果能够商品化皮肤类似物,将为中药美白药物的筛选提供一个更方便、快捷、有效的途径[28]。共培养技术的不断发展给研究者带来了新的机遇与挑战,在研究者的共同努力下将会得到更加方便、有效的药物筛选方法。
　　
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　　[收稿日期]2010-07-19 [修回日期]2010-08-31
　　编辑/李阳利