rhBMP-2HACo复合材料异位诱导成骨中碱性磷酸酶活性的检测 异位成骨

　　[摘要]目的:确定rhBMP-2/HA/Co复合制剂的生物活性,为其作为盖髓剂和根尖诱导剂提供理论依据。方法:用全自动生化仪检测rhBMP-2/HA/Co复合材料异位诱导成骨区样本单位湿重的碱性磷酸酶(ALP) 活性,并与HA/Co组对照。结果:实验组样本的单位湿重碱性磷酸酶(ALP) 活性的平均值均明显高于对照组。结论:rhBMP-2/HA/Co复合材料可作为一种新型的、具有良好生物活性的材料进一步研究,为将来的临床应用打下基础。
　　[关键词]rhBMP-2;Ⅰ型胶原;羟基磷灰石;生物活性;小鼠;碱性磷酸酶
　　[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A[文章编号]1008-6455(2010)04-0521-03
　　
　　Determining the ALP activity in ectopia osteogenesis of rhBMP-2/HA/Co compound
　　JIANG Yue-gui1,SUN Bin2,GOU Jian-zhong2,WANG Bao-yan2,SONG Jian-lin2,SUN Mo-yi3
　　(1. Department of Endodontics, the Affiliated Stomatological Hospital, Medical School of Xi"an Jiaotong University,Xi"an 710004,Shaanxi,China; 2. The Affiliated Stomatological Hospital, Medical School of Xi′an Jiaotong University, Xi"an 710004, Shaanxi,China; 3. Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Stomatological College, the Fourth Military Medical University,Xi′an 710032,Shaanxi,China)
　　
　　Abstract:ObjectiveDetermining the biological activity of rhBMP-2/HA/Co in order to use them in pulp capping and apexification.MethodsAutomatic Chemistry Analyzer be used to evaluating the ALP activity of every sample-unit-wet-weight of rhBMP-2/HA/Co and HA/Co.ResultsThe average value of ALP activity in all samples unit-wet-weight of rhBMP-2/HA/Co group were apparently higher than those of HA/Co group.ConclusionWith fine biological activity, rhBMP-2/HA/Co compound can be studied furtherly to find out their application.
　　Key words:rhBMP-2;typeⅠcollagen;Hydroxyapatite;biological activity;mice;ALP
　　
　　重组人骨形态发生蛋白-2(recombinant human bone morphogenetic protein-2, rhBMP-2)是一种高效骨生长因子,可异位诱导软骨和骨的形成,但单独使用时有局限性。复合了载体材料后的rhBMP-2具有更高效的诱导成骨活性,同时还可以减少rhBMP-2的用量[1]。本研究将rhBMP-2与生物相容性好、有骨传导能力的Ⅰ型胶原(typeⅠcollagen, Co)和羟基磷灰石(hydroxyapatite, HA)复合,检测复合材料异位诱导成骨部位的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性,确定复合物的生物活性,为进一步将其作为盖髓剂和根尖诱导剂提供依据。
　　
　　1材料和方法
　　1.1 主要试剂和仪器:rhBMP-2(中国人民解放军军事医学科学院基础研究所,中国)、Ⅰ型胶原(四川大学生物材料工程公司,中国)、HA(四川大学生物材料工程研究中心,中国)、Ca(0H)2(上海第二医科大学,中国)、透析袋(Pierce Chemical公司, 美国)、全自动生化仪(HITACHI公司,日本)。
　　1.2 材料的制备:用盐酸胍溶解法[2]分别制备rhBMP-2/Co/ HA和 HA/Co复合材料。将经过活性检测的rhBMP-2 完全溶解在4mol/L的盐酸胍溶液中,制成悬浮液。按比例加入?型胶原,待其溶解后,加入羟基磷灰石充分混匀。室温搁置12hr,真空排气30min,对50倍三蒸水于4℃ 透析72hr,每12h换一次液,冷冻干燥。?型胶原与羟基磷灰石(HA/Co)复合方法同上。将2种复合材料10mg/份分装。环氧乙烷熏蒸消毒。-20℃冰箱保存。使用时每份加入80g/L的甲硝唑,用生理盐水调成糊状。
　　1.3 实验分组:实验组:rhBMP-2/HA/Co(含rhBMP-20.025mg/mg复合材料);对照组:(载体组)HA/ Co。
　　1.4材料的植入:取昆明种雄性小白鼠9只,体重18～20g。每只小鼠的两个后肢随机分为2组。实验组和对照组各有9个实验部位。乙醚吸入麻醉,采用小鼠后肢肌囊模型,剪毛消毒,切开皮肤,钝性分离暴露股部外侧肌肉的肌间隙,分别植入实验组及对照组复合材料10mg/部位。分层缝合,标记。
　　1.5 标本的处理:术后2周处死小鼠。切取植入区组织,将样本一分为二,一半用于碱性磷酸酶(ALP)活性测定,另一半做其它指标检测。
　　1.6 碱性磷酸酶活性(ALP)测定:每个样本的一半做标记,精确定量。常温下置于匀浆器中,加入2ml生理盐水研磨成匀浆,吸入离心管中。先后用2ml生理盐水洗匀浆器2次,均吸入同一离心管中,1000 r/min,离心10min。取上清液0.5ml在HITACHI全自动生化仪检测碱性磷酸酶(ALP) 活性。每个样本读值3次,取平均值,均以样本湿重为除数,求得每毫克湿重样本中的ALP活性(U/g)。
　　
　　2结果
　　实验组和对照组材料植入2周后,单位湿重样本中碱性磷酸酶活性测定结果(表1)。经配对t检验,t=8.826>t0.01,P 　　Ⅰ型胶原具有良好的生物相容性、生物降解性及较高的抗张强度和弹性,能够支持多种不同组织的成长并兼具力学性能,其多孔的海绵状结构是良好的药物释放系统,可根据临床医学应用的不同目的制成不同性能、形状的复合材料,且作用不受移植部位的影响,具有良好的骨传导活性,是rhBMP-2较理想的载体[4]。但单独植入鼠的肌体内未见成骨现象[5]。羟基磷灰石无毒,强度大,在成分和结构上与人骨相似,具有良好的生物相容性和骨传导活性[4]。
　　在软组织中诱导骨形成必需具备三个基本条件,即诱导因子,靶细胞和适宜的环境。最理想的部位是肌肉、筋膜和骨髓等部位[6]。大量实验研究证实了rhBMP-2与其它人工材料复合后具有良好的生物活性[7-8]。这些结果均表明rhBMP-2可直接作用于成骨细胞,刺激成骨细胞的表达。含有重组人骨形态发生蛋白2 的骨修复材料(骨优导)已经作为国内第1 个III 类医疗器械注册并获得国家食品药品监督管理局(SFDA)的批准[9]。
　　3.2关于碱性磷酸酶及本实验:本研究通过盐酸胍溶解法制备出rhBMP-2/Ⅰ型胶原/羟基磷灰石复合材料,将rhBMP-2制成溶液,将疏松多孔的胶原膜浸入溶液中,rhBMP-2可随液体进入膜的孔隙内,再用透析的方法滤去盐酸胍,这样rhBMP-2与胶原膜的复合较为完全而且均匀。
　　BMP可刺激分化表型标志物的表达,如碱性磷酸酶、骨钙的合成等。Takuwa等[10]报道了在成骨细胞培养基中BMP-2刺激碱性磷酸酶活性和胶原合成的研究结果。样本的碱性磷酸酶ALP活性与骨形成高度相关,是反映骨细胞活性增加的重要标志。碱性磷酸酶活性是检测骨形成的量化指标的常用方法[10-11]。在本研究中,实验组和对照组单位湿重样本中碱性磷酸酶活性的均值经统计学对比显示具有显著性差异。说明与对照组相比,实验组复合材料具有异位诱导成骨的能力。
　　该复合材料具有良好的骨诱导能力可能的原因是:①材料复合后rhBMP-2能够发挥良好的诱导成骨活性;②本研究的复合方法:即将rhBMP-2和Ⅰ型胶原溶解、加入羟基磷灰石,然后透析、冻干的复合方法,可使复合物的结构更容易牢固吸附rhBMP-2,降低了rhBMP-2在体内的降解率,使其在局部发挥更为持久的生物诱导活性作用;③用Ⅰ型胶原蛋白和羟基磷灰石作载体不仅保留了rhBMP-2的生物活性,而且还可提供有利于骨质沉积的支架,避免了BMP的快速破坏,减少了BMP的用量。本实验因条件所限,未能制备出不同浓度梯度的rhBMP-2/Ⅰ型胶原/羟基磷灰石复合材料,无法了解复合材料诱导成骨的量效关系中rhBMP-2最佳浓度。但在本研究中,每只小鼠植入的复合材料是10mg,仅含rhBMP-2 0.25mg,即能够异位诱导成骨。
　　综上所述,本研究用盐酸胍溶解法复合的rhBMP-2/HA/Co具有良好的生物活性。可作为盖髓剂、根尖诱导剂进一步进行动物实验研究。
　　
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　　[收稿日期]2009-12-22 [修回日期]2010-03-20
　　编辑/张惠娟