重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶_黄芪甲苷对紫外线诱导皮肤成纤维细胞表达TGFβRⅡ与Smad7的影响

　　[摘要]目的：探讨黄芪甲苷对紫外线诱导皮肤成纤维细胞TGFβRⅡ、Smad7mRNA以及蛋白质表达的影响。方法：培养原代人皮肤成纤维细胞，UVA及UVB分别照射人成纤维细胞，黄芪甲苷进行干预，MTT法检测细胞增殖活性，以ELISA 法检测Smad7的生成量，半定量RT-PCR法检测TGFβRⅡ、Smad7 的mRNA表达，Western blot法检测TGFβRⅡ的蛋白表达。结果：不同浓度的黄芪甲苷干预组与正常对照组相比，成纤维细胞增殖活性随浓度增加而增强，药物浓度为40μg/ml时最显著（P 　　1.2 原代人成纤维细胞培养：取健康儿童环切包皮，利用细胞培养法，加入含20%小牛血清的DMEM培养液，待成纤维细胞融合至80%～90%时消化传代，实验选用3～8代细胞。
　　1.3 药物的配置：取0.05g黄芪甲苷干粉溶于0.5ml二甲基亚砜 ( DMSO)， 配成浓度为100mg/ml的贮存液，-20℃保存，临用时用DMEM 培养液倍比稀释，使其终浓度分别为3、5、10、20、30、40、45、50μg/ml。
　　1.4 MTT法测细胞增殖活性及药物最适浓度：制备单细胞悬液，接种于96孔板中，等细胞贴壁生长至70%～80%时，加入不同浓度的黄芪甲苷，培养24h后换回无药物的培养基， 再向每孔(含100μl培养基)加入20μl浓度为5mg/ml的 MTT，孵育 4h，弃上清，加入150μl DMSO，置恒温振荡器内振荡10min，酶标仪测定各孔在490nm处吸光值(A值)，计算细胞活性以及选取最佳药物浓度。每种药物浓度4个复孔，重复3次试验。
　　1.5紫外线照射及实验分组：将细胞接种在直径10cm的培养皿中，用含10%FBS的DMEM培养液于37℃、5%CO2温箱孵育，待细胞生长至80%～90%时进行实验。实验分5组，A组 (正常对照组)：未经任何处理； B组（UVA照射组）；C组（UVB照射组）；D组（As+UVA组）：用黄芪甲苷孵育2h，弃去，PBS洗1次，再以UVA照射，照射后继续以含黄芪甲苷的DMEM培养；E组（As+UVB组）：用黄芪甲苷孵育2h，弃去，PBS洗1次，再以UVB照射，照射后继续以含黄芪甲苷的DMEM培养；以上加药组均以浓度为40μg/ml（经MTT所测得药物最适浓度）的黄芪甲苷处理，B组、D组以10J/cm2的UVA照射，C组、E组以30mJ/cm2的UVB照射，照光后各组均加入相应的无血清DMEM培养基继续培养24h后，收集细胞上清液用于ELISA，细胞用做RT-PCR及Western blot。
　　1.6 ELISA法检测细胞上清Smad7分泌量：加入黄芪甲苷干预24h后，收集上清液。严格按照试剂说明书进行。
　　1.7 半定量RT-PCR测定细胞TGFβRⅡ和Smad7mRNA表达变化：细胞总RNA提取严格按trizol提取液说明书进行，按照相应的PCR试剂盒逆转录合成cDNA；按以下引物进行RT-PCR扩增：
　　 Smad7引物（301bp）
　　F-primer 5" -CCT CCT TAC TCC AGA TAC CCA -3"
　　R-primer 5" -GCT GAC TCT TGT TGT CCG AAT -3"TGFβRⅡ引物（81bp）
　　F-primer 5"-CTG CGT CTG GAC CCT ACT CTG T-3"
　　R-primer5"-TTC TGG AGC CAT GTA TCT TGC A-3"
　　β-actin做内参照引物（271bp）
　　F-primer 5"-CTA CAA TGA GCT GCG TGT GGC-3"
　　R-primer 5"-CAG GTC CAG ACG CAG GAT GGC-3"
　　扩增条件：预变性94℃5min； 变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃45s，循环35次；最后72℃7min延伸。最后取 PCR产物l0μl在2%琼脂糖凝胶中电泳，紫外凝胶成像系统扫描成像。
　　1.8 Western blot检测TGFβRⅡ的蛋白水平：于照光加药后24h收集各实验组细胞，以M- PERTM (Pierce)蛋白提取液分别处理细胞，收集细胞总蛋白，BCA法定量后经 SDS-PAGE，电转膜，免疫抗体反应，最后化学增强发光法(ECL)显带。
　　1.9 统计学处理：数据以（x±s）表示，用SPSS13.0统计软件对实验数据进行单因素方差分析，P 　　黄芪甲苷作为一种植物活性成分， 可以通过多种途径抑制紫外线对皮肤的损伤。本实验研究结果表明，黄芪甲苷能显著抑制UV对体外培养的人成纤维细胞的光损伤，这一效应同黄芪甲苷促进成纤维细胞增殖和调节TGF-β/Smad信号传导密切相关。
　　
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　　[收稿日期]2010-10-20 [修回日期]2011-01-06
　　编辑/张惠娟