Herkinorin预处理减轻缺血性卒中模型大鼠脑损伤

宋婉晴，李俊发，崔 旭*

1.首都医科大学附属北京同仁医院 麻醉科，北京 100730；
2.首都医科大学 神经生物学系，北京 100069

脑缺血/低氧损伤是缺血性卒中常见的病理生理过程，发病率、致死致残率高, 目前临床上仍缺乏有效的治疗方法[1]。缺血/低氧预处理(ischemic-hypoxia preconditioning，I/HPC)是指在短时间内给予机体亚致死性缺血/低氧刺激后，可显著提高机体对继发严重缺血/低氧事件耐受性的方法。

I/HPC可以用药物预处理促进内源性物质释放或作用于信号通路来模拟。Herkinorin作为半合成阿片受体激动剂，可通过调节短暂性大脑中动脉阻塞(transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO)致缺血性卒中小鼠脑皮层半影区内蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)膜转位水平，来发挥脑保护作用[2-3]。早期研究显示，Herkinorin通过抑制NF-κB/NOD样受体蛋白3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)通路，减轻氧-糖剥夺(oxygen-glucose deprivation，OGD)神经元缺血损伤[4]。本研究拟在大鼠tMCAO模型上，进一步探讨Herkinorin对NLRP3的调节作用及其可能机制。

1.1 材料

1.1.1 实验动物：SPF级SD大鼠，体质量 200～220 g，雌雄各半 [南京大学动物模式中心提供，动物合格证号：SCXK(苏)2015-0001]。

1.1.2 实验试剂：Herkinorin、TTC染液(Sigma-Aldrich公司)；
蛋白抽提试剂盒(Sangon公司)；
PVDF膜(0.45 μm，Millipore公司)；
TUNEL染色试剂盒、细胞凋亡试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)；
GAPDH抗体、IL-1β抗体、NLRP3抗体、p-p65抗体和p65抗体(Abcam公司)；
β-抑制蛋白2(β-arrestin2)抗体、IκBα抗体、phos-IκBα抗体、Na-K ATPase抗体和caspase-1抗体(CST公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分组及处理：采用随机数字表法，将大鼠分为假手术组(sham)、模型组(tMCAO)、Herkinorin组(Herkinorin)，每组6只。模型(tMCAO)组及Herkinorin组大鼠进行造模处理-左侧大脑中动脉阻塞2 h后再灌注24 h。Herkinorin组大鼠造模前腹腔给药Herkinorin(10 mg/kg)1周，每天1次，缺血过程中给药1次，sham组及tMCAO组给予等体积1% DMSO。再灌注24 h后，对所有大鼠进行神经功能评分、TTC染色、TUNEL染色、Western blot检测和免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，Co-IP)。

1.2.2 神经功能评分：评分标准：0分-神经功能正常；
1分-轻度神经功能缺损：提尾时，动物的左前肢屈曲；
2分-中度神经功能缺损：将动物置于光滑平面上行走，行走时向左侧转圈；
3分-中度神经缺损：静止状态下，向左侧倾斜；
4分-意识减退，肢体无自发活动；
5分-对刺激无应答或死亡。

1.2.3 TTC染色检测脑梗死百分比及脑水肿率：取大鼠全脑视交叉及其前后各2 mm处的脑组织，置于含有2% TTC的磷酸缓冲溶液中，37 ℃避光温孵10 min后取出脑片，用数码相机拍照，通过Image pro-plus 6.0计算梗死百分比如下：梗死百分比(%)=苍白区质量/(苍白区质量+非苍白区质量)×100%。将染色后的脑组织置于105 ℃烘箱烘干，24 h后称重(干重)。脑水肿率计算公式如下：脑组织含水量(%)=(1-脑组织干重/脑组织湿重)×100%；
脑水肿率(%)=[各组脑组织含水量(%)-sham组脑组织含水量(%)]/sham组脑组织含水量(%)×100%。

1.2.4 TUNEL染色检测细胞凋亡：取缺血半影区脑组织制成石蜡切片，置于电热恒温干燥箱中，60 ℃烘烤3 h，用TUNEL试剂盒检测细胞凋亡，按照说明书标记后用苏木精复染，用相差显微镜随机选择一个视野使用400×倍视野下拍照，细胞凋亡率(%)=TUNEL阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.2.5 Western blot检测蛋白质表达: 取缺血半影区脑组织，制备全细胞蛋白质样品、定量、电泳和转膜后，分别加入一抗和二抗，用ECL发光显色。将PVDF膜放入数码凝胶图像分析仪进行曝光，所得图片采用Image J 件进行扫描。以GAPDH为内参蛋白，计算IκBα、p65、p-p65、pro-IL-1β、IL-1β、pro-caspase1、caspase1 p20、NLRP3的表达水平。

1.2.6 免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，Co-IP)检测IκBα与β-arrestin2结合：取缺血半影区脑组织，Co-IP检测IκBα与β-arrestin2结合水平。

1.3 统计学分析

2.1 Herkinorin预处理改善缺血性卒中鼠神经功能评分

与sham组相比， tMCAO组大鼠神经功能评分显著增加(P<0.01)；
而与tMCAO组相比，Herkinorin组大鼠神经功能评分明显下降(P<0.01)(图1D)。

2.2 Herkinorin预处理降低缺血性卒中鼠脑梗死百分比和脑水肿率

与sham组相比，tMCAO组大鼠脑梗死百分比与脑水肿率增加(P<0.01)；
与tMCAO组相比，Herkinorin组大鼠脑梗死百分比与脑水肿率下降(P<0.01)(图1A～C)。

2.3 Herkinorin预处理降低缺血性卒中鼠脑细胞凋亡水平

与sham组相比，tMCAO组大鼠脑组织缺血半影区中的细胞凋亡水平增加(P<0.01)；
与tMCAO组相比，Herkinorin组大鼠脑组织缺血半影区中的细胞凋亡水平下降(P<0.01)(图1E～F)。

A.TTC staining; B.brain infarct area percentage; C.cerebral edema rate; D neurological scores; E, F.TUNEL staining; *P<0.05 compared with sham group；
#P<0.05 compared with tMCAO group

2.4 Herkinorin预处理对缺血性卒中鼠脑半影区内IκBα、p65、p-p65、pro-IL-1β、IL-1β、pro-caspase1、caspase1 p20和NLRP3蛋白水平的影响

与sham组相比，tMCAO组大鼠脑组织缺血半影区内IκBα和p65蛋白水平下降(P<0.01，图2A～C)；
p-p65(图2A，D)、IL-1β(图2A，E～F)、caspase1 p20(图2A，G～H)和NLRP3(图2A，I)蛋白水平增加(P<0.01)。与tMCAO组相比，Herkinorin组大鼠脑组织缺血半影区内IκBα和p65蛋白水平增加(P<0.01，图2A～C)；
p-p65(图2A，D)、IL-1β(图2A，E～F)、caspase1 p20(图2A，G～H)和NLRP3(图2A，I)蛋白水平下降(P<0.01)。

2.5 Herkinorin预处理提高缺血性卒中鼠脑半影区内IκBα与β-arrestin2的结合水平

与sham组相比，tMCAO组大鼠脑缺血半影区内IκBα与β-arrestin2结合水平下降(P<0.01)；
但与tMCAO组相比，Herkinorin预处理可提高鼠脑缺血半影区内IκBα与β-arrestin2的结合水平(P<0.01)(图2J)。

A, B.expression of IκBα; A, C.expression of p65; A, D.expression of p-p65; A, E.expression of pro-IL-1β; A, F.expression of IL-1β; A, G.expression of pro-caspase1; A, H.expression of caspase1 p20; A, I.expression of NLRP3; J.interaction of IκBα and β-arrestin2

Herkinorin是以salvinorin A为模板合成的阿片受体激动剂，其与β-arrestins亲和力低，在激动阿片受体的同时较少募集β-arrestins，不导致受体内化，这一特性使Herkinorin既具备传统阿片类药物的治疗作用，又大大减少了药物耐受、便秘、呼吸抑制等不良反应[2]。

NLRP3异常活化关系到多种疾病的发生发展。NLRP3的激活与卒中后神经细胞死亡及行为缺陷密切相关，抑制NLRP3激活可减轻神经元缺血/再灌注损伤[5-7]。

NF-κB通常以p50-p65异二聚体的形式与其抑制性蛋白IκBα结合而呈非活化状态，其通过复杂的分子调节机制参与机体的慢性炎性反应[8]。研究显示， 杨梅花青素通过TLR4/NF-κB信号通路抑制NLRP3激活，从而减轻脑缺血/再灌注损伤[9]；
环境刺激通过抑制NF-κB信号通路降低NLRP1/NLRP3活性，从而减轻脑缺血/再灌注损伤[10]。

前期研究发现Herkinorin降低大鼠OGD神经元中caspase-1、IL-1β的活化程度及NLRP3的表达水平，而μ阿片受体(μ opioid receptor，MOR)抑制剂β-funaltrexamine可以逆转此作用。Herkinorin可明显抑制NF-κB通路的活化，降低p65的磷酸化水平，上调IκBα的表达，而MOR基因敲除后Herkinorin上述能力消失。这说明Herkinorin可能通过MOR途径降低OGD神经元中p65磷酸化水平，抑制NF-κB/NLRP3通路表达。而本研究在tMCAO大鼠中进一步验证了此作用机制。

阿片受体是G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors，GPCRs)。GPCRs激活后，细胞外信号通过两个信号通路传递到细胞内：G蛋白通路和β-arrestins通路。在G蛋白通路中, GPCRs活化后募集β-arrestins，β-arrestins促进GPCRs和G蛋白解偶联及受体内化，阻止下游效应因子激活，介导受体脱敏；
在β-arrestins通路中，β-arrestins与Src、Raf-I、Akt、ERKl/2、JNK3、Mdm2和IκBα等信号分子形成复合物，调控MAPK、P53、NF-κB信号通路[11-12]。前期研究发现，Herkinorin处理大鼠OGD神经元后，IκBα与β-arrestin2结合量增加，IκBα泛素化水平降低。而β-arrestin2基因敲除后，Herkinorin抑制NF-κB通路活化，降低p65磷酸化水平，上调IκBα表达，降低 IκBα泛素化的能力消失。这说明Herkinorin抑制NF-κB通路活化可能是通过增加β-arrestin2与IκBα结合、降低IκBα泛素化实现的。本研究也发现， Herkinorin可增加IκBα与β-arrestin2的结合，稳定IκBα并抑制NF-κB激活，这表明IκBα与β-arrestin2在Herkinorin对tMCAO大鼠的神经保护机制中发挥了重要作用。

综上所述，Herkinorin可能通过抑制NF-κB/NLRP3通路减轻tMCAO大鼠脑缺血/再灌注损伤，这可能是通过增加IκBα与β-arrestin2结合实现的。