胚系BRCA,1/2基因变异与乳腺癌患者临床特征的关系

黄 斐 陈馨宁 郁 俐 姜惠琴 史庭燕 沈敏娜 张春燕，3△ 潘柏申，3 王蓓丽，3 郭 玮，3，4

（1复旦大学附属中山医院检验科，2妇瘤科 上海 200032；
3复旦大学附属中山医院厦门医院检验科 厦门 361015；
4复旦大学附属中山医院吴淞医院检验科 上海 200940）

DNA损伤是导致肿瘤的诱因之一，DNA双链断裂（DNA double-strand break，DSB）是最严重的损伤形式。在正常情况下，机体通过损伤修复通路来维持基因组的完整性和稳定性，其中同源重组（homologous recombination，HR）是DSB的主要修复方式。乳腺癌易感基因1（breast cancer gene 1，BRCA1）和乳腺癌易感基因2（breast cancer gene 2，BRCA2）是参与HR的重要基因。BRCA1/2基因变异会造成蛋白功能缺陷，导致基因组不稳定。携带胚系BRCA1/2基因变异（germlineBRCA1/2 mutations，gBRCAm）的个体终生罹患乳腺癌的风险显著增加［1-2］。同时携带gBRCAm的乳腺癌患者对聚ADP核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）抑制剂更敏感［3-5］。携带gBRCAm的乳腺癌患者预后较差，无进展生存期和总生存期均低于未携带变异患者［6］。美国国家综合癌症网络指南建议对乳腺癌患者进行常规gBRCAm检测［2，7-8］。

BRCA1/2基因变异位点和类型较多，随机分布于整条基因序列，无明确热点。目前，多采用二代测序（next-generation sequencing，NGS）和多重连接依赖性探针扩增技术（multiplex ligationdependent probe amplification，MLPA）检测gBRCAm。BRCA1/2基因变异存在地域、种族和癌种的异质性，因此研究乳腺癌患者的BRCA1/2基因变异谱对风险评估、诊疗管理具有重要的意义。本文采用NGS检测146例未经筛选的乳腺癌患者的gBRCAm，分析乳腺癌gBRCAm类型和分布情况，并探讨其与临床特征的关系。

研究对象选取2019年6月至2021年4月于复旦大学附属中山医院就诊的146例乳腺癌患者。入组标准：经活检或手术病理确诊为乳腺癌。排除标准：（1）合并其他原发肿瘤；
（2）转移乳腺癌；
（3）伴有其他全身性严重疾病的患者。其中男性患者2例，女性患者144例，中位年龄为（53.7±13.3）岁。本研究获得复旦大学附属中山医院伦理委员会批准（批件号：B2021-056），且获得患者知情同意。

胚系BRCA 1/2基因变异检测采集146例患者EDTA-K2抗凝全血，采集到的2 mL全血按血液DNA核酸提取试剂盒（厦门艾德生物医药股份有限公司）说明书流程提取基因组DNA。采用Qubit dsDNA HS试剂（美国ThermoFisher公司）检测DNA浓度，保证投入量为50 ng。根据BRCA1/2基因突变检测试剂盒（厦门艾德生物医药股份有限公司）要求建库。采用Qubit dsDNA HS和DNA 1000试剂（美国Agilent公司）对文库质检，要求浓度＞0.5 ng/μL，片段分布在260～400 bp，无明显引物二聚体及杂峰。使用Miseq Dx和Miseq V2芯片测序（美国Illumina公司）。采用艾德“人类1/2基因高通量测序数据分析软件”（v1.1.4）ADXHS-gBRCACNV模块分析测序数据，获得gBRCAm预分类结果。所有样本满足平均有效测序深度＞300，测序质量＞75%，比对率85%，覆盖度100%。本检测包括BRCA1基因（NM_007294.3）外显子2、3、5～24以及BRCA2基因（NM_000059.3）外显子2～27及外显子-内含子连接区、UTR区（非翻译区）和启动子区的点突变和插入缺失突变。根据美国医学遗传学与基因组学学会（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）遗传解读原则，基于人群数据、计算数据、功能数据、共分离数据等证据将变异分为5类，包括良性、疑似良性、意义不明确、疑似致病和致病变异，本文提及的gBRCAm为疑似致病和致病变异。对检出的疑似致病或致病变异进行一代测序验证。采用MLPA对分析软件输出的大片段重排（large rearrangement，LR）进行验证。

临床资料收集乳腺癌患者一般临床资料和组织病理资料，包括发病年龄、确诊时肿瘤发生部位、前哨和腋窝淋巴结状态、组织学分级、雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕酮受体（progesterone receptor，PR）和 人 表 皮 生 长 因 子 受 体-2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）。

统计学方法数据分析采用SPSS 23.0软件。计数资料以率表示。采用χ2检验和Fisher精确检验比较gBRCAm在乳腺癌中的分布，探讨其与临床特征的关系。所有均为双侧检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

胚系BRCA 1/2基因变异在乳腺癌中的分布在146例乳腺癌患者中，检出18例患者携带gBRCAm，人群变异频率为12.3%，其中8例发生BRCA1基 因 变 异，10例 发 生BRCA2基 因 变 异。在癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库中乳腺癌患者携带gBRCAm频率为5.3%［9］。本研究中乳腺癌患者携带gBRCAm的频率显著高于TCGA数据库报道（P=0.023），且携带BRCA1和2基因变异频率分别为5.5%和6.9%，分布无明显偏向（图1）。

图1 不同研究中乳腺癌患者携带gBRCAm的频率Fig 1 Prevalence of gBRCAm from patients with breast cancer in different studies

胚系BRCA 1/2基因变异分布和类型特征94.4%（17/18）的变异发生于外显子，仅5.6%（1/18）的变异发生于内含子剪接区。16.7%（3/18）的肿瘤患者携带的变异发生于BRCA1基因的外显子11，38.9%（7/18）的肿瘤患者携带的变异发生于BRCA2基因的外显子11，乳腺癌患者携带的变异多见于BRCA2基因的外显子11。在检出的18个不同变异中，移码突变是最主要的变异类型（61.1%），无义突变、大片段重排和剪接突变比例分别为16.7%、11.1%和5.5%，检出1例（5.5%）同义突变（图2A）。BRCA1基因中检出5种不同类型的变异，而BRCA2基因中仅检出3种不同类型的变异（图2B）。在BRCA1和BRCA 2基因上各检出1例LR携带者，均为大片段缺失。在检出的变异中，乳腺癌患者携带BRCA2基因c.5682C＞G的频率最高，但未发现热点或潜在始祖突变，其中NM_000059.3：c.6043_6055del13C为新发现变异，未见其他文献和ClinVar数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar）报道。变异在蛋白功能和结合域的分布如图3A和3B所示，大部分变异发生于BRCA 1和BRCA 2蛋白的重要功能区和结构域上。

图2 乳腺癌患者胚系BRCA 1/2基因变异类型和分布Fig 2 Variation type and distribution of gBRCAm in breast cancer patients

图3 胚系BRCA 1/2基因变异在蛋白功能和结合域的分布Fig 3 Distributions of gBRCAm in functional domains and protein binding regions

胚系BRCA 1/2基因变异与乳腺癌临床和病理特征的关系146例乳腺癌患者中，收集到94例患者的一般临床资料和组织病理资料。在不同乳腺癌人群中胚系BRCA1/2基因变异情况存在差异，胚系BRCA1/2基因变异多见于早发乳腺癌（P＜0.001）、肿瘤家族史（P=0.008）、双侧乳腺癌（P=0.001）和三阴型乳腺癌（P=0.025），且BRCA1基因变异与三阴型乳腺癌发生密切相关（P=0.007，表1）。进一步分析发现胚系BRCA1/2基因变异与肿瘤分级（P=0.031）、PR状态（P=0.040）和HER2状态（P=0.039）相关，但与前哨和腋窝淋巴结转移（P=0.048和0.085）和ER状态（P=0.260）无关（表2）。在ER和PR阳性组中，携带BRCA2基因变异的乳腺癌患者显著多于携带BRCA1基因变异的患者（P=0.041和P=0.026）。BRCA1基因变异携带患者中，三阴型和Luminal B型分别为75%和25%，而BRCA2基因变异携带患者中，57.1%为Luminal B型，28.6%为Luminal A型，14.3%为HER2表达型。

表1 不同乳腺癌人群中胚系BRCA 1/2基因变异情况Tab 1 Status of gBRCAm in breast cancer patients in different categories ［n（%）］

表2 乳腺癌患者胚系BRCA 1/2基因变异与肿瘤病理特征的关系Tab 2 Associations of clinicopathological characteristics with gBRCAm in breast cancer patients ［n（%）］

BRCA1/2基因属于抑癌基因，其编码蛋白参与DNA损伤修复、基因转录调控和细胞周期调节等多种细胞生命活动过程。基因功能缺陷会增加乳腺癌的发生风险。目前国内有多项针对乳腺癌患者BRCA1/2基因变异的研究，但不同研究中的BRCA1/2基因变异特征以及其与临床特征间的关系存在一定差异［10-15］，这与入组患者的疾病背景差异有关，因此本中心希望通过区域性数据的积累和研究，建立区域化的BRCA1/2基因变异特征数据库。本研究采用NGS检测146例未经筛选的乳腺癌患者gBRCAm，分析乳腺癌gBRCAm类型和分布情况，研究其与临床特征的关系，为患者的精准诊疗积累相关人群数据。

本研究中乳腺癌患者携带gBRCAm频率为12.3%，高于数据库报道和其他国内未经筛选的乳腺癌人群［10-13］。94.4%变异发生于外显子区域，移码变异、无义变异和大片段重排是最常见的致病和疑似致病的变异类型。检出的大部分变异处于BRCA 1和BRCA 2蛋白的重要功能区和结构域。BRCA 1蛋白由N末端RING区（外显子2～7）、多蛋白结合点和功能区（外显子11～13）和C末端BRCT区（外显子16～24）［16］。本研究中16.7%变异发生于BRCA1基因的外显子11，该区域发生的变异可能影响BRCA 1蛋白参与DNA修复、细胞周期或核定位的功能，与早发乳腺癌和卵巢癌相关［14］。BRCA 2蛋白由DNA结合区、3个寡核苷酸结合区、塔 区、8个BRC重 复 区、N末 端PALB 2结 合 区 和C末 端RAD 51结 合 区 构 成［16］。38.9%变 异 发 生 于BRCA2基因的外显子11，该区域发生的变异可能影响同源重组过程中其与RAD 51蛋白的相互作用［14］。研究显示BRCA1基因发生LR多于BRCA2基因［17］，而本研究中在BRCA1基因和BRCA2基因各发生了1例LR，由于入组患者人数少未发现这种偏向。BRCA1基因发生LR多于BRCA2基因的主要原因在于Alu介导的HR是导致LR的主要机制，且BRCA1基因中Alu密度高于BRCA2基因［18-19］。女性罹患乳腺癌的风险随BRCA1/2基因变异类型、发生位置改变而改变［20］。

本研究中40%携带gBRCAm的乳腺癌患者确诊的平均年龄在35岁以下，低于未携带变异患者。低分化级别乳腺癌、三阴型乳腺癌和双侧乳腺癌患者多携带gBRCAm，在不同淋巴结状态的患者中差异 无 统 计 学 意 义，与 其 他 研 究 报 道 一 致［10，15］。BRCA1基因变异在三阴型乳腺癌的比例高达33.3%；
激素受体表达在携带gBRCAm的乳腺癌中差异较大。研究报道，BRCA1基因抑制ER在乳腺癌和前列腺癌细胞中的表达［21］，因此本研究中BRCA1基因变异倾向于ER、PR阴性表达，而BRCA2基因变异倾向于ER、PR阳性表达，而HER-2在亚组分析中倾向于阴性表达。

综上，本研究通过NGS检测中国区域性人群未经筛选的乳腺癌患者gBRCAm特征，研究gBRCAm与乳腺癌临床特征的关系。本研究纳入乳腺癌患者例数较少，gBRCAm组和不同突变亚组的例数较少，可能造成研究结果的偏倚；
本研究为单中心研究，无法全面勾勒中国人群gBRCAm，仅能作为区域性特征的研究，因此需要多中心研究积累中国人群数据库。我们正在不断累积乳腺癌患者gBRCAm的数据，深入研究不同癌肿的变异图谱，并联合患者不同治疗方式进行全面分析，以期为肿瘤患者个体精准诊疗和癌症风险评估等奠定基础。

作者贡献声明黄斐样本检测，数据统计，论文构思、撰写和修订。陈馨宁，郁俐样本检测。姜惠琴，史庭燕患者入组，临床资料收集。沈敏娜样本收集。潘柏申，王蓓丽，郭玮研究指导。张春燕实验设计，论文修改和指导。

利益冲突声明所有作者均声明不存在利益冲突。