睡眠剥夺对动物肠黏膜屏障的影响

姜小寒,牛婉珑,张艳香,陈耀星,曹 静,董玉兰,王子旭

(中国农业大学动物医学院，北京 100193)

睡眠是一种生理现象,睡眠质量能够影响动物机体的健康状况。研究发现，睡眠时间不足的煤矿职工往往患有功能性消化不良(functional dyspepsia,FD)[1]。随着时代步伐的不断加快，无法满足自身正常睡眠需求的人群越来越多，随之造成的肠道疾病已明细威胁公众健康，需要人们关注。

睡眠剥夺(sleep deprivation,SD)是指由于环境刺激或自身原因而不能满足正常睡眠的状态，并常伴有生理功能的改变。肠黏膜屏障是抵御病原菌和外来物质入侵的第一道防线，是防止病原菌感染、预防炎症的关键组成成分，对维持和调节机体内环境稳态有重要意义[2]。

国内外研究表明，睡眠剥夺可通过损伤肠道黏膜屏障，进而引起各种炎症性肠病(Inflammatory bowel disease，IBD)。哈佛大学医学院的研究者发现，经睡眠剥夺后的果蝇和小鼠的肠道中有活性氧(reactive oxygen species,ROS)以及氧化性应激效应的积累，从而导致动物机体死亡[3]。睡眠剥夺与胃肠道反应之间的关系及睡眠剥夺对动物肠黏膜屏障的影响值得我们深入探讨。本文将主要阐述睡眠剥夺对肠道黏膜屏障产生的影响并对相关干预与治疗手段进行展望。

肠黏膜机械屏障结构复杂，主要由覆盖在上皮细胞表面的黏液层、肠上皮细胞 (intestinal epithelial cells,IEC)、上皮细胞间紧密连接 (tight junctions,TJ) 共同构成，是肠黏膜屏障的结构基础[4]。睡眠剥夺可通过影响肠绒毛高度、隐窝深度和细胞间连接结构等来影响肠黏膜机械屏障。

1.1 睡眠剥夺对肠绒毛高度的影响

肠黏膜位于肠道管壁的最内层，其表面的指状绒毛是由黏膜上皮和固有膜突入肠腔而形成。高婷等[5]研究表明，睡眠剥夺可导致小鼠的小肠绒毛高度降低。肠绒毛高度可作为评价肠黏膜屏障损伤程度的指标，如果肠黏膜屏障损伤严重，超出自我恢复的范围，就会引起肠绒毛高度下降，肠黏膜机械屏障通透性增加。因此，睡眠剥夺通过改变小肠绒毛形态损伤肠黏膜屏障，使得致病菌和内毒素等有害物质更易于侵入机体，导致小肠消化吸收功能受到影响。

1.2 睡眠剥夺对隐窝深度的影响

在正常情况下，隐窝底部的干细胞不断分化并迁移到绒毛的末端，形成具有吸收能力的肠上皮细胞，以补充正常脱落的肠绒毛上皮细胞，脱落的细胞自噬死亡，并被周围细胞吞噬[6]。肠道隐窝中细胞增殖和死亡的失衡，自噬增加和有丝分裂活性降低，可导致肠道腺细胞增殖减弱[7]。隐窝深度(crypt)可用来说明肠上皮细胞的生成率，肠隐窝深度与肠上皮细胞成熟度成反比。隐窝深度越浅，说明肠上皮细胞成熟度越高，对营养成分的吸收程度越高。睡眠剥夺降低肠上皮细胞生成率的具体表现为减少细胞增殖和增加细胞自噬。

1.2.1 睡眠剥夺减少肠上皮细胞的增殖 小肠黏膜的所有上皮细胞来源于隐窝干细胞，隐窝干细胞的发生、分化、增殖、分布等过程，直接影响肠黏膜的完整性和功能特异性[8]。研究发现睡眠剥夺下调了增殖细胞核抗原(proliferative cell nuclear antigens,PCNA)在小肠中的表达。PCNA可通过参与小肠细胞增殖过程,诱导小肠黏膜上皮细胞由绒毛底部隐窝处开始不断地分裂增殖,并逐渐向绒毛上方迁移分化成熟[9]。PCNA量的变化与DNA合成一致，其在细胞中的表达可用作评估细胞增殖状态的指标[10]。综上所述，睡眠剥夺影响肠上皮细胞增殖，隐窝干细胞堆积，肠上皮自然脱落的细胞无法得到补充，肠黏膜完整性受损，其功能减弱。

1.2.2 睡眠剥夺增加肠上皮细胞的自噬 细胞自噬必须要有ATG5和BECLIN-1这两种自噬相关蛋白质参与才能完成。ATG5通过使膜聚集以形成新的自噬体，BECLIN-1通过与凋亡抑制蛋白质结合抑制正常情况下细胞自噬的发生，而当细胞生存环境异常时，BECLIN-1与凋亡抑制蛋白质解离，诱导自噬发生[11]。高婷等[6]评估了睡眠不足小鼠的小肠上皮细胞自噬水平，发现睡眠剥夺显著上调了自噬蛋白(ATG5和Beclin1)的表达，增加细胞的自噬并促进细胞的自噬过程，加速肠绒毛上皮细胞的脱落，不利于维持小肠的正常发育和消化吸收。睡眠剥夺引发的自噬功能异常不仅能够影响肠道的功能，还可能会成为慢性肠道炎症的诱因，从而导致更严重的肠道结构损伤。

1.3 睡眠剥夺对紧密连接蛋白表达的影响

相邻细胞间的连接结构包括自上而下排列的紧密连接、黏附连接和桥粒3种结构。紧密连接是肠黏膜上皮细胞之间的主要连接方式,主要由咬合蛋白(occludin)、闭合蛋白(claudin)及闭合小环蛋白(ZO-1、ZO-2和ZO-3)等组成[12]。紧密连接复合物的完整性是上皮屏障调节肠屏障功能及通透性的关键。首先，作为物理屏障，可阻止肠腔内细菌、毒素等有害物质经细胞旁间隙渗漏至黏膜下组织；
其次，作为选择性过滤器，可允许营养物质及水分子通过[13]。高婷等[14]实验数据表明睡眠剥夺会导致occludin、claudin-1和ZO-1表达下调。这些紧密连接蛋白的数量变化直接影响肠黏膜的完整性和通透性，导致肠黏膜的相对损伤，并破坏机械屏障，降低肠的消化吸收能力。

肠黏膜化学屏障由肠黏膜上皮细胞分泌的黏液、消化液和肠道寄生菌产生的抑菌物质等构成。

杯状细胞合成的分泌型黏蛋白 (mucin 2,MUC2)主要参与构成肠道黏液，可起到润滑肠黏膜、协助益生菌定植、隔离肠道微生物与宿主上皮细胞、免疫细胞的接触以有效防止肠道过度炎性反应等作用，对维持肠黏膜稳态具有重要意义。高婷等[14]研究发现，睡眠不足可导致杯状细胞数量减少进而使MUC2的表达下调。

研究表明，MUC2参与构成的肠道黏液层与肠上皮细胞、微生物群和宿主免疫防御之间呈动态相互作用，对维持肠黏膜稳态具有重要作用，而MUC2的缺陷使黏液屏障功能减弱和肠黏膜渗透性增加，引起肠黏膜细胞的炎症和损伤[15]。综上所述，睡眠剥夺可通过引起黏蛋白MUC2表达下调进而影响肠黏膜化学屏障的功能。

胃肠道结构和功能辅以庞大的肠黏膜面积构成了强大的黏膜免疫系统，是动物体内最大的免疫器官，在维持肠道微生物稳态，抑制炎症因子，参与机体免疫调节等方面发挥重要作用。在小肠上皮细胞中，其表面的黏膜层和潘氏细胞分泌的抗菌肽共同构成了肠道黏液屏障；
结构完整、排列紧密的肠上皮细胞构成黏膜免疫的第二道防线，产生多种细胞因子及免疫球蛋白，在免疫过程中发挥重要作用。

3.1 睡眠剥夺对肠上皮细胞抗菌肽分泌的影响

肠道抗菌肽是一种防御性肽类活性物质，可以用于对抗外源性病原体致病作用。抗菌肽作为天然免疫系统的一部分在机体对抗感染及炎症中发挥重要作用。

有研究报道，睡眠剥夺可影响抗炎细胞因子水平的下调、肠道菌群的失衡等，从多方面导致结肠黏膜损伤，最后引起结肠炎[16]。刘伟等[17]的试验结果提示一旦肠道中发生细菌感染和炎症反应时，其抗菌肽的表达量均发生不同程度的变化。

肠道上皮细胞可提供启动和调节炎性反应的早期信号并分泌抗菌肽，可作用于神经元表达的G蛋白偶联受体发挥免疫作用[18]，也可以直接作用于肠道内的病原菌，从而共同维持肠道健康。如果某一环节抗菌肽表达减少，则会导致肠道菌群失调或易位，使得肠上皮屏障功能减弱，从而引起相应肠道疾病。

睡眠剥夺对动物体内防御素、溶菌酶等的抗菌肽表达量及活性的直接影响研究方面还存在许多空白，有待进一步研究。然而，近年来越来越多的研究报道了不同的外源性抗菌肽对肠道上皮屏障功能的调节作用，甚至有望取代抗生素，这也为解决睡眠剥夺造成的动物健康问题提供了新思路。

3.2 睡眠剥夺对肠黏膜免疫球蛋白分泌的影响

分泌型免疫球蛋白(secretory immunoglobulin A,sIgA)是肠黏膜免疫的主要免疫球蛋白，不仅可以阻止抗原进入上皮组织，还可以保护正常菌群免受先天免疫和系统免疫反应的影响。

sIgA通过与病原体表面抗原的结合起到抑菌剂的作用，同时也有利于黏液对病原体的捕捉及抗菌肽发挥杀菌作用。王景杰等[19]的研究表明睡眠剥夺对胃肠道黏膜免疫功能有显著的影响，随着睡眠剥夺时间的不断延长，大鼠胃肠道 sIgA 水平逐渐下降，sIgA 的缺乏会导致肠道正常菌群过量生长移位，导致异常的免疫系统反应。

潘氏细胞具有转运和分泌sIgA的功能，主要位于肠黏膜固有层。陶凯忠等[20]研究发现72 h睡眠剥夺使小鼠潘氏细胞功能减弱，从而影响sIgA的分泌。充足的睡眠具有整体保护作用，睡眠不足会增加感染的易感性，使肠道免疫屏障功能受损，对肠道单层上皮细胞造成损害，并影响肠黏膜免疫机制，sIgA分泌减少，还可能导致胃肠道黏膜的损伤及炎症性肠病。

3.3 睡眠剥夺影响肠黏膜免疫细胞发挥作用

3.3.1 睡眠剥夺对肠黏膜淋巴细胞增殖活力的影响 大多数免疫细胞在夜间的免疫反应性最高，而在早晨的反应性最低，睡眠时段的变化是否可能会影响免疫功能的调节呢？Wilder-Smith A等[21]研究发现，睡眠剥夺会导致 T 淋巴细胞亚群平衡失调，这可能与睡眠不足导致机体抗感染能力下降有关。

机体免疫活动中的抗感染途径主要由肠相关淋巴样组织完成，包括组织性淋巴组织和弥散分布的淋巴细胞，组织性淋巴组织由派伊氏结 (Peyer patch,PP) 、肠系膜淋巴结及孤立淋巴滤泡等组成，是肠黏膜免疫的诱导位点，主要负责抗原的摄取和转运；
弥散分布的淋巴细胞包括肠黏膜固有层淋巴细胞(lamina propria lymphocytes,LPL)和肠上皮内淋巴细胞(intraepithelial lymphocytes,IEL)，是肠黏膜免疫系统的效应位点，在此被抗原激活的淋巴细胞产生免疫球蛋白和各种免疫因子[22]。

有研究报道随着睡眠剥夺时间的不断延长，大鼠胃肠道黏膜IEL和LPL的增殖逐步趋于低活力状态[19]，LPL中的CD4+T细胞的活化性强、增殖率低且受到分裂原刺激时能产生更多的细胞因子，IEL主要由CD8+T细胞组成，在维持肠道上皮屏障的完整性方面有着重要作用，这进一步佐证了睡眠剥夺会影响肠黏膜淋巴细胞增殖活力，导致T淋巴细胞平衡失调。

3.3.2 睡眠剥夺对肠黏膜细胞因子分泌水平的影响 黏膜免疫系统的特点是有大量免疫细胞和免疫分子弥散在黏膜上皮内以及黏膜下，通过特殊的共刺激信号、黏附分子和效应分子将肠道黏膜系统的细胞网络紧密联系在一起，其中细胞因子的表达、分泌对黏膜免疫系统的调节作用具有重要意义。

Tang Y M等[23]在一项研究中对患有结肠炎的小鼠进行睡眠剥夺，结果表明急性和慢性睡眠剥夺都导致结肠炎恶化，并可能继发性地引起炎症的细胞因子，如IL-6和TNF-α的分泌增加[24]，其中IL-6由Th2辅助细胞分泌，主要通过刺激B细胞生长和分化，参与体液免疫反应过程[25]，因此，降低血浆 IL-6、TNF-α 水平对改善睡眠质量、缓解睡眠剥夺的损伤有重要意义。

此外，也有研究发现被剥夺睡眠3 d的小鼠皮质醇分泌增加，反映下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamic pituitary adrenal,HPA)轴被激活，说明睡眠剥夺可作为一种应激原。睡眠剥夺会导致活性氧(reactive oxygen species,ROS)的积累和随之而来的氧化应激，特别是引起肠道的氧化应激[3]，使得NF-κB通路被激活，抑制炎症因子表达下调，诱导炎性细胞因子如TNF-α和IL-1β产生，最终导致炎症反应，使小肠黏膜损害，影响小肠营养物质的吸收[14]。

睡眠剥夺不仅影响机体消化能力，而且会引起肠黏膜免疫功能的变化，影响淋巴细胞的增殖活力、细胞因子分泌水平，造成肠道黏膜免疫功能的损害，诱发一系列氧化应激及炎症反应，且据以上研究推测，淋巴细胞及细胞因子的改变与炎症反应的发生二者之间存在一定的正反馈作用机制。

肠道内正常共生菌对病原菌的定植抵抗作用及其菌间聚集构成了生物屏障，在肠黏膜保护中发挥重要作用，肠道内正常共生菌可以通过竞争病原菌的黏膜位点定植、竞争营养物质摄入以及产生代谢物抑制病原菌、促进上皮细胞增殖分化或激活肠道黏膜免疫等方式抑制肠道内病原菌的过度繁殖和易位，降低炎症反应和氧化应激[26]。睡眠剥夺可通过引起细菌易位、造成肠道细菌紊乱使得肠黏膜生物屏障损伤，从而影响其发挥保护作用。

4.1 睡眠剥夺引起细菌易位

肠道细菌易位是指肠道内细菌或其产物(内毒素)突破肠黏膜屏障进入肠系膜淋巴结或门静脉系统,从而远离肠道的其他器官。Everson A等[27]发现，睡眠剥夺所引起的病理变化以细菌易位较为突出。取经过5 d睡眠剥夺大鼠的回肠、盲肠以及肠系膜淋巴结等肠外组织进行细菌培养，结果均出现阳性。陶凯忠等[20]研究表明，72 h睡眠剥夺即可引起细菌向肠组织移位，并通过血液、淋巴途径向肠外组织扩散。

4.2 睡眠剥夺引起肠道微生物群生态失衡

肠道菌群是指定居在动物体胃肠道内所有微生物的总称，由厌氧菌、兼性厌氧菌和需氧菌组成。肠道内的细菌约99%为专性厌氧菌，专性厌氧菌主要分布在深层，因其紧贴在肠黏膜表面，被糖衣包被，比较稳定，故能形成膜菌群，从而有效阻止表层具有潜在致病性的需氧菌、外来菌或肠道中的条件致病菌直接黏附于肠黏膜细胞[28]。致病菌则以需氧或兼性厌氧菌为主，能引起宿主疾病，正常情况下在肠道无法长期定植[29]。总之，肠道菌群的组成结构与宿主的健康状况有着紧密的联系，而睡眠剥夺可通过打破动物肠道菌群的生态平衡进而诱发一系列疾病。

研究表明，厚壁菌门和拟杆菌门的比率是肠道微生物群结构改变的重要指标[30]。高婷等[14]研究发现睡眠剥夺显著降低了小鼠肠道内拟杆菌的相对丰度并增加了厚壁菌门的相对丰度，结肠内容物中厚壁菌门与拟杆菌门的比例增加。这说明睡眠剥夺破坏了肠道微生物群的正常结构，导致肠道菌群紊乱。此项研究还发现，经睡眠剥夺后小鼠肠道内的细菌种群组成也发生了变化，小鼠结肠中有益细菌(阿克曼氏菌、拟杆菌和粪杆菌)的丰度更低，而有害细菌(气单胞菌，属于变形菌门)的丰度更高。这些有害菌可能会释放肠毒素，从而增加肠道的通透性，诱导免疫抑制蛋白的产生，导致免疫功能障碍，破坏肠道上皮细胞，并影响能量代谢导致肠道炎症[14]。除此之外，高婷等[14]通过α-多样性分析表明，睡眠剥夺性显着降低小鼠肠道微生物群的多样性和丰富度。

此外，研究人员对健康成年人进行了40 h的睡眠剥夺，发现睡眠剥夺会引起肠道菌群紊乱以及系统性炎症反应，并通过粪便菌群移植的方法进一步发现肠道菌群平衡失调也会对动物机体的脑功能行为产生重要影响[31]。

5.1 外源性补充褪黑素对肠道的作用

鲜为人知的是褪黑激素其实是一种有效的抗氧化剂[3]，对胃肠道系统的代谢紊乱和氧化分子损伤具有保护作用，这些发现提示褪黑素可能参与了肠道的调节平衡睡眠不足引起的疾病。研究发现睡眠剥夺的小鼠血浆褪黑激素水平显著降低，外源性补充褪黑素可通过抑制NF-κB的活化和抗氧化应激来显著改善和逆转睡眠剥夺诱导的肠黏膜损伤和肠道菌群失调[14]。

李瑞盈等[32]研究表明，脑肠轴在疾病病理的机制过程当中起到一个非常重要的作用，而褪黑素既产生于松果体，也产生于胃肠道黏膜的肠嗜铬细胞。这提示可以通过探索褪黑素对肠道的作用机制及脑肠轴对肠道炎症的调控机制，使褪黑素能够被更合理、更安全地运用在预防和治疗睡眠剥夺诱导的肠道疾病中。

5.2 摄入小檗碱对肠道的作用

先前的研究结果表明，小檗碱能对肠道菌群产生双向调控作用，既提高有益菌的相对丰度又降低有害菌的相对丰度。小檗碱还可通过抑制脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)，影响Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)信号通路来减少炎症因子的分泌，缓解胃肠黏膜的损伤[33]。但小檗碱对不同生理状态下动物肠道菌群调控的作用机制尚不明确，还有待于进一步研究。

5.3 调节IEL对肠道的作用

IEL是最先遇到外源抗原的T淋巴细胞，可通过调节肠上皮细胞功能、调节免疫反应来维护肠黏膜免疫屏障。通过研究如何调节IEL以增加IBD患者对致病菌群的免疫耐受性，进而修复损伤的肠黏膜免疫屏障，也可为肠道炎症疾病的治疗提供新思路。

5.4 粪菌移植对肠道的作用

此外，人们也尝试利用粪菌移植(fecal microbiota transplantation,FMT)的方法来改善动物肠道菌群失调，即通过将健康动物粪便中的功能性菌群移植到患病动物肠道内以重建具有正常功能的肠道菌群。粪菌移植已在临床上广泛应用于艰难梭状芽孢杆菌相关性疾病、炎症性肠病、肠易激综合征和肠道免疫缺陷性疾病等肠道疾病的治疗，并取得了良好临床效果[34]。这说明目前粪菌移植已成为治疗由睡眠剥夺诱发的肠道炎症的一种潜在方法。但目前在临床实践中尚未证实最佳FMT移植途径[35]，还有待于进一步研究。

睡眠对生物机体的生长发育至关重要，在畜牧养殖业中，由于各种外界环境原因导致的睡眠剥夺，引发的动物健康问题也备受关注。近年来的研究表明，睡眠剥夺可通过影响肠黏膜屏障来影响动物的肠道功能，睡眠剥夺对于肠道的机械屏障、化学屏障、免疫屏障、生物屏障均有不同程度的影响。

目前针对睡眠剥夺对肠黏膜屏障影响的研究领域还存在许多空白，其分子作用机制也有待于进一步深入研究。此外，人们还应加大力度研究修复或增强胃肠道稳态的方法，可通过研发食源性途径摄入的天然、安全的替代药物或相应的治疗手段等，对干预和治疗睡眠剥夺诱发的动物肠道炎症均具有广阔的应用前景。