无乳链球菌感染方式对罗非鱼血常规和抗体消长规律的影响

顾海闻，农源，蒋薇，2，王冬英，梁万文，陈汉忠，吴文德*

（1广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530004；
2贺州市水产畜牧兽医站，广西贺州 542899；
3广西水产科学研究院，广西南宁 530021）

【研究意义】罗非鱼是引入我国养殖最广泛的鱼类，具有杂食性、生长迅速、适应力强等特点（林虹等，2013）。近年来，我国罗非鱼产业发展迅速，其养殖产量和出口量均居世界首位，罗非鱼养殖业已成为我国渔业的主要组成部分（Yuan et al.，2017；
敖秋桅和朱佳杰，2020）。广西是我国罗非鱼的养殖主产区之一，但在广西各养殖区域罗非鱼无乳链球菌病常呈暴发性流行，养殖户为了控制疫情通常滥用各种药物，致使病原菌普遍产生耐药性，严重威胁广西水产养殖业的健康发展（吕小丽等，2017）。据统计，2011年广西地区因无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）感染引起的罗非鱼死亡量超过7000 t，经济损失达8610.8万元；
2012年罗非鱼无乳链球菌感染给我国渔业造成的经济损失达12亿元（张行等，2020）。无乳链球菌是一种条件性致病菌，当罗非鱼皮肤和肠黏膜受损时，病原菌更易侵入鱼体加重感染及增加死亡率。因此，探索无乳链球菌感染方式对罗非鱼血常规的影响及特异性抗体产生的消长规律，对开展罗非鱼养殖业疫情预警和制定无乳链球菌抗体判断标准均具有重要意义。【前人研究进展】表皮是鱼类与水生环境间的生物屏障，可保护鱼类免受传染病感染（Ellis，2001），而皮肤损伤直接影响鱼类对细菌或病毒的易感性（Noble et al.，2012）。近年来，已有学者对鱼类皮肤屏障受损原因及其与细菌感染间的关联进行大量研究。Greaves和Tuene（2001）研究提出鱼眼球受到创伤会引起严重的细菌继发感染；
Barthel等（2003）使用有绳结的网进行养殖鱼群转池时会造成鱼鳍表皮受损，进而增加鱼类疾病的感染率及死亡率；
Braithwaite和McEvoy（2004）发现鱼类在游泳时擦掉鳞片将极大增加患细菌或病毒病的风险；
Harmache等（2006）研究发现传染性造血坏死病毒会通过鱼鳍损伤部位侵入体内而造成感染；
D’Orbcastel等（2009）研究表明，饲养密度过高及抽水时水流速度太快均会增加鱼体碰撞造成体表受损的概率；
Løvoll等（2009）发现体表受损的大西洋鲑鱼更易感染Moritella viscosa；
Jin等（2009）研究表明，寄生虫侵染橄榄比目鱼表皮后通常引起皮肤炎症和损伤，继发细菌感染，导致单核细胞和巨噬细胞水平明显降低；
Rombout等（2014）研究发现，当病原体从硬骨鱼肛门进入受损肠道内时，仅需少量抗原量就能引发全身抗体水平显著升高；
Koppang等（2015）认为鱼鳃表面黏膜受损将增大病原体侵入的概率，并引起鱼体强烈的炎症反应。【本研究切入点】无乳链球菌可通过粪口传播感染周围鱼群，同时腹腔注射、肌肉注射、鳃接种、鼻腔接种、浸泡、灌胃含菌饲料等方法均能致使罗非鱼感染无乳链球菌而发病（刘溪等，2015；
罗伟等，2018；
敖秋桅和朱佳杰，2020）。此外，有学者开展了高盐碱度、低溶解氧和高水温等环境因素与无乳链球菌易感性间的关联研究（祝璟琳和杨弘，2013），但鲜见针对无乳链球菌感染与罗非鱼创伤或炎症关联的报道，因此妨碍了新型有效药物及候选疫苗分子的发现。【拟解决的关键问题】通过建立罗非鱼皮肤创伤模型和肠炎模型，模拟自然环境下罗非鱼体表损伤和细菌性肠炎，以健康罗非鱼为对照，对不同健康状况的罗非鱼进行无乳链球菌浸泡感染，观测急性感染无乳链球菌后的鱼体健康状况，检测白细胞数量和种类变化及免疫应答血清抗体IgM的消长规律，旨在明确表皮损伤或某种原因造成的炎症是否是罗非鱼无乳链球菌病暴发的重要诱因，为罗非鱼养殖业疫情预警及无乳链球菌疫苗研制提供参考依据。

1.1 试验材料

吉富罗非鱼（平均体质量约40 g）购自广西南宁罗非鱼良种场，暂养于消毒过的鱼池（长7.0 m×宽1.5 m×高1.2 m）内，每天饲喂人工配合饲料，水温保持在20~25℃，全天24 h供氧。无乳链球菌HN株和罗非鱼阴、阳性血清及HRP标记鼠抗罗非鱼IgM单克隆抗体由广西大学动物科学技术学院寄生虫实验室保存提供。间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐、红细胞裂解液和四甲基联苯胺（TMB）购自Sigma公司；
HRP标记羊抗鼠抗体购自北京康为世纪生物科技有限公司；
脱脂奶粉、0.01 mol/L PBS（pH 7.2~7.4）粉末、大豆蛋白胨、胰蛋白胨及氯化钠购自北京北京索莱宝科技有限公司；
三硝基苯磺酸（TNBS）购自Thermo Scientific公司。

1.2 试验方法

1.2.1 无乳链球菌培养.对无乳链球菌HN株进行复苏，在含5%兔血的胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）上划线培养，挑取单个典型菌落接种至胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）中，37℃培养24 h，培养菌液6000 r/min离心5 min，弃上清液，细菌沉淀加入灭菌生理盐水，用麦氏比浊管调整浓度至1.5×106CFU/mL。

1.2.2 试验分组与处理.将180尾健康罗非鱼随机分为3组（健康组、皮肤创伤组和肠炎组），每组60尾。皮肤创伤组处理：用无菌打孔器在靠近罗非鱼背鳍部打2个孔（孔径1.5 mm，孔深1.0 mm），放入32℃的50 L水族箱饲养。肠炎组处理：参考宋学宏（2015）的方法，罗非鱼禁食24 h后放入60 mg/L间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐溶液中浸泡麻醉10 min，采用聚丙烯管插入罗非鱼肛门上端1 cm处，灌入0.06 mL的2.5%三硝基苯磺酸乙醇溶液，放入32℃水族箱饲养。饲养2 d待罗非鱼生命状态稳定后向水族箱（长60 cm×宽45 cm×高55 cm）投入10 mL的1.5×106CFU/mL无乳链球菌悬液感染罗非鱼。同时设3组空白对照组，不感染无乳链球菌，每组60尾。恒温加热棒控制水温维持在32℃，全天24 h供氧，定时观察罗非鱼的发病和死亡情况，连续观察7 d。所有罗非鱼均参考广西大学动物试验伦理审查（GXU2020-010）进行处理。

1.2.3 白细胞计数测定.分别于无乳链球菌感染前及感染后24、48、72、96、120、144和168 h等8个时段，从健康组、皮肤创伤组和肠炎组中随机选取15尾罗非鱼，进行鱼尾鳍静脉采血，采集的血液样品经台盼蓝染色后采用白细胞计数仪（Bio-Rad全自动细胞计数仪）进行计数，统计外周血白细胞总数，同时经吉姆萨染色后观察并统计淋巴细胞、中性粒细胞和单核细胞数量。统计感染无乳链球菌7 d内各处理组罗非鱼的死亡尾数。

1.2.4 抗体测定.抗体测定参照吴文德等（2020）的方法：将1.5×108CFU/mL的菌悬液加入酶标板孔中，50 μL/孔，56℃烘箱烘干；
加入-20℃预冷的甲醇，100 μL/孔，室温固定15 min，弃甲醇，用蒸馏水洗涤3次，5 min/次；
每孔加入200 μL 5%脱脂奶粉，放入恒温箱37℃封闭2 h，PBS洗涤3次，5 min/次；
将待检血清进行1∶4稀释，每孔加入100 μL，放入恒温箱中37℃反应1 h，PBS洗涤3次，5 min/次；
每孔加入100 μL以PBS按1∶5000稀释的HRP标记鼠抗罗非鱼IgM单克隆抗体，放入恒温箱中37℃反应1 h，PBS洗涤3次，5 min/次；
每孔加入100 μL TMB-H2O2显色液，放入恒温箱中37℃避光显色20 min；
每孔加入50 μL的2 mol/L H2SO4终止反应，置于酶标仪上读取OD450值。

1.3 统计分析

采用Origin 2018和Graph Pad v9.0进行试验数据统计分析。其中，多时间点试验数据选用双因素方差分析（Two-way ANOVA），组间差异则采用LSD-t检验。

2.1 罗非鱼几种白细胞的形态特征

经姬姆萨染色后在1000×显微镜下进行观察，结果（图1）发现，单核细胞的细胞核很大，染色较深，呈紫红色，且偏向于细胞一侧，细胞质染色较浅；
淋巴细胞一般呈圆形，细胞核圆形，所占比例大，质地紧密，细胞质所占比例很小，仅在细胞核外围形成细窄环状，细胞质淡染，细胞核深染呈紫红色；
嗜中性粒细胞呈圆形，细胞核大、致密，偏向细胞一侧，且通常分成两叶，呈紫红色，细胞质则呈淡紫色。

图1 罗非鱼几种白细胞的形态特征（姬姆萨染色）Fig.1 Morphology of white blood cells of tilapia（WBCs）

2.2 不同处理组罗非鱼的感染死亡情况

由图2可知，与健康组罗非鱼相比，皮肤创伤组和肠炎组罗非鱼的死亡时间提前，健康组罗非鱼至感染后第7 d的累计死亡率为33.3%，皮肤创伤组和肠炎组则分别为53.3%和46.7%，均呈显著升高趋势（P＜0.05，下同），说明宿主的机体损伤会促进感染加重及病程延长。

图2 不同处理组罗非鱼感染无乳链球菌后7 d内的存活率比较Fig.2 Comparison of survival rates of tilapia in different groups within 7 d after artificial infection with S.agalactiae

2.3 不同处理组罗非鱼外周血白细胞数量的变化趋势

试验期间，各感染组罗非鱼外周血白细胞数量均呈先增加后减少的变化趋势（图3）。皮肤创伤组和肠炎组罗非鱼分别在感染无乳链球菌后72和24 h上升至峰值，且极显著高于健康组罗非鱼（P＜0.01，下同）。除感染后24和144 h外，皮肤创伤组罗非鱼感染无乳链球菌后的外周血白细胞总数量均显著或极显著高于健康组罗非鱼；
肠炎组罗非鱼从感染无乳链球菌起直至感染后48 h，其外周血白细胞数量均极显著高于健康组罗非鱼，至感染后72 h下降至与健康组罗非鱼无显著差异（P＞0.05，下同）。至感染后168 h，由于健康组罗非鱼外周血白细胞数量进一步下降，低于初始值，导致皮肤创伤组和肠炎组罗非鱼外周血白细胞数量又极显著高于健康组罗非鱼。可见，无乳链球菌感染皮肤创伤或患有肠炎的罗非鱼相对于健康鱼能引起更强烈的免疫反应。

图3 不同处理组罗非鱼感染无乳链球菌后外周血白细胞数量的变化情况Fig.3 Changes in the number of peripheral blood leukocytes of tilapia in different groups after artificial infection with S.agalactiae

2.4 不同处理组罗非鱼外周血中性粒细胞数量的变化趋势

皮肤创伤组和肠炎组罗非鱼经浸泡感染无乳链球菌后，其外周血中性粒细胞数量迅速增殖，从感染后24 h即与健康组罗非鱼存在极显著差异（图4）。皮肤创伤组和肠炎组罗非鱼的外周血中性粒细胞数量分别在感染后96和24 h后达峰值，皮肤创伤组罗非鱼在感染后168 h内持续极显著高于健康组罗非鱼，肠炎组罗非鱼则在感染后24~48 h内极显著高于健康组罗非鱼，之后逐渐下降至正常水平，至感染后168 h再次极显著高于健康组罗非鱼。

图4 不同处理组罗非鱼感染无乳链球菌后外周血中性粒细胞数量的变化情况Fig.4 Changes in the number of neutrophils in blood of tilapia in different groups after artificial infection with S.agalactiae

2.5 不同处理组罗非鱼外周血单核细胞数量的变化趋势

由图5可看出，皮肤创伤组和肠炎组罗非鱼经浸泡方式感染无乳链球菌120和24 h后，其外周血单核细胞数分别上升至峰值。皮肤创伤组罗非鱼在感染后72~168 h的外周血单核细胞数量均极显著高于健康组罗非鱼，而肠炎组罗非鱼只在感染后24 h极显著高于健康组罗非鱼，之后降至正常水平。

图5 不同处理组罗非鱼感染无乳链球菌后外周血单核细胞数量的变化情况Fig.5 Changes in the number of monocytes in blood of tilapia in different groups after artificial infection with S.agalactiae

2.6 不同处理组罗非鱼外周血淋巴细胞数量的变化趋势

皮肤创伤组和肠炎组罗非鱼在感染无乳链球菌后72和24 h，其外周血淋巴细胞数量分别达峰值。皮肤创伤组罗非鱼从感染后24~168 h的外周血淋巴细胞数量均极显著高于健康组罗非鱼；
肠炎组罗非鱼在感染后24~48 h的淋巴细胞数量极显著高于健康组罗非鱼，感染后72~96 h则显著或极显著低于健康组罗非鱼，但感染后144~168 h肠炎组罗非鱼的外周血淋巴细胞数量再次极显著高于健康组罗非鱼（图6）。

图6 不同处理组罗非鱼感染无乳链球菌后外周血淋巴细胞数量的变化情况Fig.6 Changes in the number of lymphocytes in blood of tilapia in different groups after artificial infection with S.agalactiae

2.7 不同处理组罗非鱼血清IgM抗体水平的变化趋势

由图7可看出，皮肤创伤组和健康组罗非鱼感染无乳链球菌后产生特异性IgM抗体的时间较接近，均在第3周后大幅升高；
相对于健康组罗非鱼，皮肤创伤组罗非鱼的特异性抗体维持时间更久，7周后才降至正常水平，健康组罗非鱼则在6周时已降至正常水平。与皮肤创伤组和健康组罗非鱼相比，肠炎组罗非鱼感染无乳链球菌后产生特异性抗体的时间更早，1周后即开始大幅升高，持续6周后才降至正常水平。

图7 不同处理组罗非鱼感染无乳链球菌后血清IgM抗体水平的变化情况Fig.7 Changes in the IgM antibody level in serum of tilapia in different groups after artificial infection with S.agalactiae

与哺乳动物相似，鱼类的免疫系统分为特异性免疫和非特异性免疫。外周血白细胞数量的变化直接影响鱼体特异性免疫和非特异性免疫的应答功能（Kaattari and Piganelli，1996；
Manning and Nakanishi，1996；
Secombes，1996）。鱼类受细菌、病毒及有毒物质侵染时，其白细胞数量发生显著变化，如遭受嗜水气单胞菌感染的日本鳗鲡（张伟妮等，2011）及患败血症的鲢鱼（米瑞芙等，1993），其白细胞数量显著增多；
摄入杀虫剂的鲤鱼（王媛等，2005），其白细胞数量随杀虫剂浓度的升高而增加。白细胞借助变形特性穿透血管壁，行使趋化功能，移动至细菌、毒素、机体细胞降解物等有害物质处，包围并利用胞内各种酶系分解或消化吞噬有害物质。本研究也证实，罗非鱼外周血白细胞数量的变化与机体损伤、炎症及免疫反应相关，即白细胞数量变化可作为判断罗非鱼感染无乳链球菌后病理损伤和免疫应答的一个参考指标。白细胞按有无胞内颗粒物可分为有颗粒白细胞和无颗粒白细胞两大类，前者主要是中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞，后者包括淋巴细胞和单核细胞。中性粒细胞在感染初期发挥抵御病原菌入侵的作用，淋巴细胞则主要参与特异性免疫应答。李利和张其中（2007）以车轮虫感染罗非鱼，结果发现其淋巴细胞和中性粒细胞在感染初期呈显著上升趋势；
但Pasnik等（2005）研究表明注射疫苗的罗非鱼感染无乳链球菌后47 d其抗体水平才开始显著上升，于感染后90 d达峰值。本研究中，罗非鱼感染无乳链球菌后的抗体水平上升时间较Pasnik等（2005）的研究结果提前，可能与本研究的无乳链球菌感染浓度较高有关。

罗非鱼机体出现损伤或炎症时，其外周血白细胞数量显著增加，主要是由于中性粒细胞和淋巴细胞的增多而引起，与Ranzani-Paiva等（2004）以分歧杆菌腹腔感染尼罗罗非鱼后的白细胞数量变化趋势相似。皮肤创伤组和肠炎组罗非鱼的无乳链球菌感染死亡率明显高于健康组罗非鱼，而感染空白对照组无罗非鱼死亡现象，说明罗非鱼感染无乳链球菌后会加重因转池、运输、寄生虫感染等造成鱼体表皮受到的损伤，或饲料霉变等原因造成的肠炎，从而促使罗非鱼死亡。在3种感染方式中，罗非鱼的中性粒细胞数量与未感染无乳链球菌时相比均明显增加，因此可作为罗非鱼感染无乳链球菌的重要判定指标之一。鱼类白细胞中的单核细胞具有活跃的变形运动和吞噬能力，能吞噬并分解侵入机体的细菌，是结缔组织巨噬细胞的前身，在一定条件下可分化为巨噬细胞等而参与免疫反应，同时作为天然免疫和获得性免疫间的重要环节，可将抗原产物传递给淋巴细胞，协助淋巴细胞在免疫过程中发挥重要作用（袁仕取等，1998）。此外，皮肤创伤组和肠炎组罗非鱼的外周血单核细胞数量显著高于空白组罗非鱼，说明无乳链球菌感染会加重罗非鱼自身表皮受损或某些原因产生的炎症，无乳链球菌在自然条件中广泛存在，是条件性致病菌，因此可将单核细胞数量变化作为监测罗非鱼是否受感染无乳链球菌的参考指标。淋巴细胞来源于骨髓多能造血干细胞，可划分为T淋巴细胞、B淋巴细胞、K细胞和NK细胞，T淋巴细胞和B淋巴细胞受抗原物质刺激后能分化增殖产生免疫活性细胞，在免疫应答过程中起核心作用（Vallejo et al.，1992）。本研究中，健康组罗非鱼在感染无乳链球菌后期其淋巴细胞数量显著升高，而皮肤创伤组和肠炎组罗非鱼均在感染后期出现淋巴细胞数量下降现象，说明机体损伤和炎症对罗非鱼免疫反应有抑制作用，与Verburg-van Kemenade等（1999）、Engelsma等（2003）的研究结果一致，即遭受应激的鱼体血液皮质醇浓度增加引起淋巴细胞数量减少、嗜中粒细胞数量增加的表现一致，说明其作用机制存在一定关联性。

在细菌入侵时，鱼体也会与哺乳动物一样产生针对病原菌的特异性抗体。IgM是鱼类特异性免疫应答中最主要的介质之一，其血清抗体效价可直接反映鱼体免疫接种的效果及病原菌感染后对鱼体造成的影响（陈昌福，1998）。本研究中，不同健康状况下以无乳链球菌感染罗非鱼均会产生明显的特异性抗体，且达峰值后高抗体水平能维持一段时间。但不同机体条件下罗非鱼感染无乳链球菌产生的免疫应答能力有区别，特异性抗体产生的时间也存在时效差异，健康组罗非鱼在遭受无乳链球菌侵袭时，其皮肤的固有屏障作用致使大部分抗原颗粒停留在皮肤和鱼鳃中，仅有相对少量的抗原进入机体，免疫应答也主要发生在黏膜免疫组织，因此血清抗体出现较皮肤创伤组和肠炎组罗非鱼晚，且血清抗体水平维持时间较短，消退较快。皮肤创伤模型制的人工造创口较小，皮肤的完整性和皮肤黏膜免疫并无明显下降趋势，在感染无乳链球菌后其血清抗体产生的时间与健康组罗非鱼相近，但相对于健康鱼体，浸泡感染过程中无乳链球菌更易从创口进入机体，且在后续的感染过程中无乳链球菌持续作用，血清抗体达峰值后较健康组罗非鱼持续的时间更长。在肠炎组罗非鱼中，鱼体抵抗环境病原体侵袭的最初屏障受损，肠黏膜系统对鱼类免疫保护机能下降，黏膜免疫系统此时无法独立于系统免疫完成免疫应答，大量无乳链球菌进入机体，血清抗体出现时间早且达峰值时间长。可见，提高有效抗体水平的维持时间是确保罗非鱼无乳链球菌疫苗免疫成功的关键。

罗非鱼在无乳链球菌感染前后并发机械性或免疫性病理损伤及炎症，会导致感染死亡率升高，即感染无乳链球菌后会加重因转池、运输、寄生虫感染等造成鱼体表皮受损，或饲料霉变等原因造成的肠炎，进而导致罗非鱼死亡率上升。血常规和抗体水平的消长规律能反映罗非鱼无乳链球菌的感染情况，其中，外周血白细胞数量变化可作为判断罗非鱼感染无乳链球菌后病理损伤和免疫应答的参考指标。