尿酸酶缺失大鼠的血细胞和血液流变学变化*

万绪莲，李律宇，李 丹，罗光云，李 宁，云 宇，段为钢△

（1.云南中医药大学，云南 昆明，650500；
2.云南中医药大学第三附属医院，云南 昆明 650500；
3.昆明医科大学，云南 昆明 650500）

高尿酸血症已经成了危害人类健康的“第四高”[1]，与痛风、高血压、糖尿病等疾病高度关联[2-3]。为了研究高尿酸血症的发病机制以及相关疾病的防治新策略，我们前期以SD大鼠为试验大鼠，采用CRISPR/Cas9技术成功研制了尿酸酶缺失大鼠（Kunming-DY大鼠）[4]。该大鼠血尿酸明显升高，与成年男性血尿酸相似或略高，可以稳定繁殖，成年后的1年生存率可达90%[4-5]，尽管具有轻度的多器官损伤[6]。由于该大鼠无尿酸酶活性，其尿酸代谢与人进一步相似，可以避免造模剂带来的干扰，有望为高尿酸血症和相关疾病的防治研究提供更好的模型动物[5]，同时该模型动物在研究高尿酸血症方面表现出一定的优势[7-9]。为此，本研究以45 d日龄SD大鼠为对照，特观察同龄尿酸酶缺失大鼠血细胞和血液流变学变化。

1.1 实验材料与仪器 雄性尿酸酶缺失大鼠（Kunming-DY大鼠）由实验室自制，按照SFP标准繁育。雄性SD大鼠（生产许可证号：SCXK（滇）K2015-0002）由昆明医科大学按照SPF标准繁育。尿酸检测试剂盒（磷钨酸法）（南京建成生物工程研究所）、氨丁三醇（Tris碱，>99.9%）（德国 BioFroxx公司）、全自动动物血细胞分析仪（型号：PE-3070VET）（深圳市普康电子有限公司）、全自动动物血液流变仪（型号：HL5000）（康宇医疗器械有限公司）、酶标仪（型33号：K6600-A）（北京凯奥科技发展有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组 随机选取10只40 d日龄的SD大鼠（WT）和7只尿酸酶缺失大鼠（Uox-/-），适应性饲养到第45 d日龄称重置于代谢笼记录24 h出入量。实验后置于固定器从尾部采抗凝血（EDTA-K2抗凝）0.2 mL用于血细胞分析。动物用乌拉坦（1.0 g/kg）麻醉后从腹主动脉采抗凝血（肝素抗凝）3 mL用于血液流变学检测，同时采不抗凝血0.5 mL用于血尿酸检测。

1.2.2 血细胞检测 按照说明书操作开启全自动动物血细胞分析仪，选择大鼠模块，将采到的EDTA-K2抗凝血混匀后直接进样检测，收集检测数据。2 h内完成血样收集和血细胞检测。

1.2.3 血液流变学检测 按照说明书操作开启全自动动物血液流变仪，选择大鼠模块，将采到的肝素抗凝血混匀后置于预定的进样盘，自动检测，收集检测数据。2 h内完成血样收集和血液流变检测。

1.2.4 尿酸检测 血液样品凝固后于3 000 r/min，离心5 min制备血清，制备的血清直接用于尿酸检测。尿酸的含量测定方法则按照厂家提供的说明书进行。

2.1 尿酸酶缺失大鼠的血尿酸水平、体质量和出入量变化 45 d日龄尿酸酶缺失大鼠的血尿酸明显高于野生型SD大鼠（图1A），但体质量略低于同龄野生型大鼠（图1B），且差异均有统计学意义（P<0.05），这与我们的前期研究结果一致。

不考虑体质量因素时，45 d日龄的尿酸酶缺失大鼠的24 h进食量无明显变化（图1C），但24 h饮水量（图1D）和24 h排尿量（图1E）明显增加，同时24 h排便量却有所减少（图1F）。考虑到体质量因素时，校正后的指标尿酸酶缺失大鼠24 h进食量则明显增加（图1G），且24 h饮水量（图1H）和24 h排尿量（图1I）进一步增加，同时24 h排便量却无明显差异（图1J）。见图 1。

图1 尿酸酶缺失大鼠的血尿酸水平、体质量和出入量变化

2.2 尿酸酶缺失大鼠的血细胞指标变化 45 d日龄尿酸酶缺失大鼠的白细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和中间细胞（主要包含单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞）数目明显低于野生型SD大鼠（图2A）；
但尿酸酶缺失大鼠的淋巴细胞比例高于野生型SD大鼠，中性粒细胞略低，而中间细胞比例无明显变化（图2B）。

与野生型SD大鼠相比，45 d日龄尿酸酶缺失大鼠的红细胞数目无明显改变（图2C），红细胞压积和红细胞分布宽度CV（变异系数）无明显改变（图2D）；
但血红蛋白浓度、平均红细胞体积、平均红细胞血红蛋白含量、平均红细胞血红蛋白浓度以及红细胞分布宽度SD（标准差）明显减小（图2D）。

与野生型SD大鼠相比，尿酸酶缺失大鼠血小板数目、大血小板数目（图2E），血小板分布宽度和血小板压积（图2F）无明显改变；
但血小板体积和大血小板比率明显减小（图2F）。见图2。

图2 尿酸酶缺失大鼠的血细胞指标变化

2.3 尿酸酶缺失大鼠的血液流变学指标变化 与野生型SD大鼠相比，45 d日龄尿酸酶缺失大鼠全血高切、中切和低切黏度以及血浆黏度均减小（图3A），但相应的相对黏度增加（图3B），相应的还原黏度则进一步显著增加（图3C）。

与野生型SD大鼠相比，45 d日龄尿酸酶缺失大鼠的血液屈服应力减小（图3D），相应的低切、中切和高切流阻减少（图3E）。与血细胞检测结果类似，尿酸酶缺失大鼠的血沉减慢（图3F），其方程K值也减小（图3G）；
红细胞压积（图3H）、红细胞刚性指数（图3I）和红细胞内黏度（图3J）减小，而红细胞聚集指数、红细胞变形指数和红细胞电泳指数（图3I）则增加。见图3。

图3 尿酸酶缺失大鼠的血液流变学指标变化

野生型SD大鼠正常表达尿酸酶，表达丰度最高部位是肝脏。与传统的基因敲除不同，Kunming-DY大鼠是基于封闭群大鼠，即SD大鼠，采用CRISPR/Cas9技术敲除尿酸酶基因2～4号外显子区域[4]。先获得杂合子，通过不断交配获得纯合子，纯合子再相互交配选种获得性状较为稳定的尿酸酶缺失大鼠。

尿酸酶缺失后，该大鼠的血尿酸明显升高，但比文献报道的基于近交系C57/6J小鼠研制的尿酸酶缺失小鼠要明显的低[10]，成年后的1年生存率达90%以上，虽然表现出生长略有减慢，多饮多尿现象，但表型基本健康，也能正常繁育[4-6，11]。这些现象也在本研究中得到重现，说明该大鼠生长略有减慢，多饮多尿现象能够稳定重现。

本研究发现，与同龄野生SD大鼠不同，尿酸酶缺失大鼠的白细胞数量偏少，且淋巴细胞比例增高，说明该大鼠可能存在慢性感染。尿酸酶缺失大鼠的红细胞数量无明显变化，但血红蛋白、红细胞体积、红细胞血红蛋白含量及浓度以及红细胞分布宽度SD明显减少，说明该大鼠具有营养性贫血倾向，可能存在一定的铁利用障碍，具有小细胞低色素特征的“贫血”倾向。尿酸酶缺失对血小板数量影响较小，但血小板体积和大血小板比率均减少，说明该大鼠的血小板功能更倾向于成熟，有利于止血。

从血液流变学指标看，尿酸酶缺失后，大鼠的全血黏度、血液屈服应力、血液流阻、血沉均出现明显下降。由于血液黏度主要受红细胞影响，变小的红细胞有利于全血黏度下降。由于红细胞内的血红蛋白浓度也是下降的，因此红细胞内的黏度也由此减小。与相关黏度指标下降不同，尿酸酶缺失大鼠的还原黏度是增加的。全血还原黏度是指单位红细胞压积时的全血黏度值，考察的是单位红细胞压积对全血相对黏度的贡献。这提示在尿酸酶缺失大鼠中，单位红细胞压积对血液的黏度贡献是增加的。由于红细胞内的血红蛋白含量有所减小，红细胞的刚性也有所减弱。因为红细胞体积变小，红细胞的流动性有所改善，在电场的作用下更容易发生迁移。本研究结果表明雄性尿酸酶缺失大鼠在45 d日龄时，血尿酸水平明显升高，且具有多饮多尿现象，但其白细胞数量略有减少，多个血液流变学指标也总体改善。