肝素钠对体外培养犬子宫内膜上皮细胞子宫容受性因子表达的影响

魏华威，康国强，李 响，李东燕，魏景文★

（1.海关总署北京缉私犬基地 100142；
2.北京市公安局顺义分局刑侦支队警犬技术管理中队 100142；
3.海关总署瑞丽缉私犬基地 100142；
4.中华人民共合国北京海关 100142）

子宫是哺乳动物繁衍的重要器官，是雌性生殖系统的核心器官之一。近年来，伴随着人与犬的关系已由最初的饲养者与被饲养动物上升到伴侣动物及家人的关系，母犬繁殖障碍相关生殖器官疾病已得到兽医工作者的广泛关注。

子宫内膜健康的性状是妊娠能否成功的关键因素。研究显示，在失败的妊娠中约60%的病例与子宫内膜的不正常相关[1]。在子宫内膜的各项指标中，子宫容受性是一个十分关键的项目，其特指子宫内膜对于受精卵的接受能力，即允许胚胎在子宫进行着床的能力，该阶段特点主要是子宫内膜发生了分子和组织学上的一系列生理变化，如上皮细胞增殖被抑制、上皮细胞重塑，同时子宫内膜基质细胞发生蜕膜化。对哺乳动物而言，除了雌激素和孕激素外，还有一些其他分子生物学指标评价子宫容受性，如整合素αv，β3 (Integrin αv，β3)，同源框基因 (小时omeobox Genes， 小时OX) 家族的小时OXA10和大分子转膜黏蛋白-糖蛋白1 (Mucinglycoprotein 1， MUC-1)等[3]。

肝素具有抗血栓形成和调节免疫的作用。在人类生殖领域，肝素已被证明可改善子宫内膜血供，并通过改善子宫内膜容受性，提高胚泡植入的成功率[5]，但目前针对犬子宫内膜容受性的研究还尚无报道。基于此，本研究旨在通过体外培养犬子宫内膜上皮细胞，评估外源肝素钠（小时eparin sodium salt，小时SS）对子宫容受性因子Integrin αvβ3、小时OXA10和MUC-1蛋白表达的影响，进一步分析肝素钠的潜在治疗价值。

1.1 子宫样品收集

犬子宫由北京农学院动物医院提供，为正常犬子宫与卵巢切除术后子宫，通过卵巢状态判断为间情期阶段子宫。将手术收集的子宫组织用室温的DPBS（磷酸盐缓冲液）进行冲洗。

1.2 犬子宫内膜上皮细胞体外培养

在灭菌条件下，完成子宫内膜的剥离，用含有双青、链霉素的DPBS冲洗3次，修剪为约1m³的组织块。将处理好的组织均匀铺于细胞培养瓶中，静置1.5h后，加入含10% FBS的细胞完全培养基( DMEM/F12，HYClone) ，然后将组织放入37℃、5%浓度二氧化碳的细胞培养箱中进行培养。每隔 2d更换一次细胞液体，当细胞增殖铺满50%时，用0.25%胰蛋白酶进行纯化并传代。

1.3 子宫内膜上皮细胞的鉴定

将第二代犬子宫内膜上皮细胞移至 6 孔板中进行细胞爬片。培养5d后去除培养液并清洗3次；
然后加入4%的多聚甲醛固定10min；
清洗3次后，加入0.15% Triton X-100通透15min。用1%的BSA封闭25min后，再按1:100加入兔抗多克隆角蛋白-18抗体（北京博奥森生物技术有限公司，bs-2043R）。在4℃下恒温过夜后，按1:200再加入FITC标记的山羊抗兔荧光二抗（北京全式金生物技术有限公司，小时S121），避光孵育1h。经过DPBS再次清洗3次后，用1μg /mL DAPI避光孵育2min，清洗后用荧光显微镜进行拍照观察。

1.4 细胞处理

将第二代犬子宫内膜上皮细胞接种于6孔板中，静置培养24h后，加入基础培养基对细胞饥饿12h。加入不同浓度小时SS（终浓度为0， 10， 20和40 μg/mL，Sigma公司，美国），处理24h后收集的细胞检测子宫容受性因子Intergrin αv，β3、小时OXA10和MUC-1的表达变化。

1.5 总蛋白提取及Western Blot

将收集的细胞中加入含1%PMSF的RIPA裂解液（北京索莱宝科技有限公司），以12000 r/min离心10min后，用BCA试剂盒检测蛋白浓度；
加入4×Loading Buffer（北京索莱宝科技有限公司）于95℃变性10min并进行 SDS-PAGE电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭2h后，分别用Intergrin αv多克隆抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，10569-1-AP，1:1000），Intergrinβ3多克隆抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，18309-1-AP，1:1000），小时OXA10多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司，bs-2502R，1:1000），MUC-1多克隆抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，23614-1-AP，1:1000）和β-actin多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司，bs-0061R，1:4 000）4℃孵育过夜。清洗后，用小时RP标记的羊抗兔IgG抗体（北京博奥森生物技术有限公司，bs-0295G-小时RP，1:3000）37℃孵育2h。最后用ECL化学发光法对蛋白条带进行检测。

1.6 数据分析

上述实验收集到的数据应用SPSS Statistics 21.0软件进行单因素方差分析，然后使用Prism 5软件进行统计数据的图表绘制并做图像分析。

2.1 上皮细胞鉴定

结果如图1A所示，纯化后的犬牛子宫内膜上皮细胞贴壁后表现出明显的“铺路石”形态，通过细胞免疫荧光法检测到在犬子宫内膜上皮细胞中CK-18的表达，结果如图所示，约90%细胞的表达呈强阳性（图1B-D），实验表明所获得的高纯度细胞可以满足接下来实验的要求。

图1 子宫内膜上皮细胞（犬）的培养鉴别

2.2 不同浓度肝素钠对犬子宫内膜上皮细胞容受性因子Intergrin αv，β3、小时OXA10和MUC-1表达的影响

结果如图2所示，40 μg/mL 小时SS显著促进了Intergrin αv，β3和小时OXA10蛋白的表达 (P ＜ 0.01)；
与之相反，小时SS呈浓度依赖性的抑制MUC-1蛋白的表达 (P＜0.05)。

图2 不同浓度肝素钠对犬子宫内膜上皮细胞Intergrin αv，β3、小时OXA10和MUC-1表达的影响

子宫是胎儿生长发育和娩出的器官，其功能层是胚胎着床附植的场所，在生殖、生理研究中占据着重要地位[6]。体外培养的子宫内膜细胞是研究雌性生殖、生理或病理及母体与胚胎之间相互作用机理的最佳材料。因此，如何保证子宫内膜细胞获取后的高同一性和高纯度对于接下来体外生殖研究十分重要，该技术的成熟建立对犬繁殖学与繁殖障碍疾病的研究具有重要意义。

目前，国内外研究团队已先后成功建立了人[7]、小鼠[8]、猪[9]、牛[10]和山羊[11]等哺乳动物子宫内膜上皮细胞的培养体系。子宫内膜上皮细胞的分离培养方法较多，组织贴壁法和酶消化法是最为常见。在细胞纯化方面，应用较多的有酶消化法、机械刮出法以及反复贴壁法等[12]。原代培养的子宫细胞主要是上皮细胞和基质细胞混合生长。在用胰蛋白酶消化细胞时，由于上皮和基质细胞特性，基质细胞先脱壁，而上皮细胞则需要消化较长时间，特别是在原代和早期传代培养中差别尤为明显[13]。因此，本实验应用子宫内膜上皮细胞和基质细胞对胰蛋白酶的耐受程度不同，采用多次差时消化法即可纯化出上皮细胞。所得细胞呈铺路石状，同时利用CK18抗体进行免疫荧光染色，约95%细胞呈绿色荧光染色，表明本试验培养的犬子宫内膜上皮细胞纯度较高，可有效用于后续研究。

哺乳动物子宫处于“容受状态”时，除了发生组织学变化外，多种相关因子同样可作为标志物用于评估该生物过程。子宫内膜上皮细胞表面存在的整合素αvβ3和小时OXA10呈时空特异性表达，它们是影响哺乳动物子宫容受性的两个关键标志因子[14，15]。而抗黏附因子家族代表的MUC-1则起到阻碍胚胎植入作用，其表达的下调可以提高母体子宫的容受性，对于胚胎附植具有利作用[16]。肝素钠是肝素的衍生物，其具有抗栓活性、抗凝活性，可迅速起效，发挥持续性抗血栓形成作用[4]。在胚泡植入障碍模型小鼠中的研究发现，肝素可通过促进子宫内细胞增殖分化和血管生成促进维持子宫内膜的良好血供，进而增强子宫内膜容受性并提高胚泡的植入率[5]。有趣的是，在本实验中我们发现，肝素钠可直接作用于犬子宫内膜上皮细胞，促进其容受性标志分子Intergrin αv，β3和小时OXA10的表达，并抑制MUC-1的表达，这表明肝素钠除了通过维持子宫内膜血供外，对于子宫内膜的容受性还具有直接的调控作用。

综上所述，本研究成功建立了一种便捷、实用、高效的犬子宫内膜上皮细胞分离培养方法；
并发现40μg/mL肝素钠可通过调控Intergrin αv，β3和小时OXA10和MUC-1的表达，对于犬子宫内膜容受性的调控具有积极的实践意义，下一步我们将对其调控的机制机理展开更加深入的研究。