声带切除术后损伤修复与再生的研究进展

刘婕妤 周恩 杨慕 肖禹 秦念 张锟艺 肖旭平

声音是在大脑皮质以及皮质下神经中枢控制和协调下，通过正常的发声器官、听觉系统、神经系统共同作用形成的自动反馈的发声系统产生的[1]。

声带由甲杓肌、固有层深层、固有层中层、固有层浅层和鳞状上皮层组成，固有层深层和固有层中层形成声韧带，发声主要归功于固有层，它可以在100～1 000 Hz频率承受高达30%的应变，并且可以在短暂拉伸后快速恢复[2]。它主要由细胞外基质(ECM)组成，如：纤维蛋白(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型胶原蛋白，弹性蛋白)、间质分子(糖胺聚糖:透明质酸HA、蛋白多糖、糖蛋白)、脂质和碳水化合物；
在人和动物中声带固有层三层肉眼下并没有明显分开。固有层浅层可以在声韧带上自由移动，深层胶原蛋白和弹性蛋白越来越密集，固有层中层和固有层深层含有最高浓度的弹性蛋白和胶原蛋白(Ishii等，1996；
de Melo等，2003)；
由于硬度和粘度增加，声带局部瘢痕会影响黏膜波或声带的运动，还会导致声门闭合不完全(Benninger等，1996)。硬度和粘度增加的综合效应导致声带振动减弱，也可致发声嘶哑和疲劳(Thibeault等，2002；
Sataloff等，2015)。可见声带是人类发声的主要结构，从极轻微的声嘶到完全失声，多为声带病变或其他病因使声带的正常运动发生障碍所致。美国约3%～9%的人口患有嗓音障碍[3]，老年人嗓音障碍患病率较高[4]。故声带损伤后的修复与再生对临床以及人类日常生活和社会交际有重要意义。本文对不同手术方式及范围致声带损伤后的修复和再生研究进展进行综述，为进一步认识声带损伤及修复机制提供参考。

1.1声带锐性切除术 徐文等[5]通过在支撑喉镜下对兔一侧声带行前中部锐性切除，深达声韧带，观察到在术后3天～3个月声带固有层内细胞外基质分泌增加,主要表现为以胶原为主的纤维组织明显增多且呈无序排列,透明质酸略有增加,纤维连接蛋白明显增加;在术后6～12个月，胶原和纤维连接蛋白含量持续高于正常,声带局部瘢痕形成；
而声带瘢痕形成则可引起发声障碍甚至呼吸障碍，因此，认为在声带损伤后 3～40天可能是声带损伤介入治疗的关键时期，如果能在此时抑制胶原的沉积，可能会减少损伤后期声带瘢痕的形成。

声带损伤的预后与损伤程度直接相关。声带黏膜上皮层和固有层浅层的损伤愈合后不留瘢痕,因为固有层浅层的基质中含有许多抗瘢痕形成的物质,如：透明质酸、核心蛋白聚糖和纤维蛋白，透明质酸可以抑制成纤维细胞合成胶原及胶原沉积,核心蛋白聚糖和纤维蛋白可以阻止胶原的形成和胶原纤维的生成(Hedlund等，1994)。而固有层中层以下即声韧带甚至声带肌受损,愈合过程中纤维组织广泛增生,排列紊乱,将产生不可逆的瘢痕,导致声带黏膜波减弱或缺失及声门闭合不全,成为影响发声的两个关键因素[6]。

1.2声带CO2激光术 Remacle等(2000年)将内镜下声带CO2激光手术分为I型(声带上皮切除术)、Ⅱ型(声韧带下声带切除术)、Ⅲ型(跨肌肉声带切除术)、Ⅳ型(全声带切除术)、Ⅴ型(扩大声带切除术)5种术式，其中Ⅴ型又分为Ⅴa型：对侧声带和前连合；
Ⅴb型：杓状软骨;Ⅴc型：声门下；
Ⅴd型:喉室。

梁耕田等[7]将4只实验犬于支撑喉镜下行Remacle Ⅲ型声带CO2激光显微手术，功率为6 W；
术后6 h可见声带创面大量炎性细胞浸润、红细胞渗出，细胞充血水肿；
术后3周声带创面轻度充血水肿及炎性渗出，有成纤维细胞增生，新生血管形成，大量纤维组织无序排列；
术后8周创面充血水肿消失，局部挛缩凹陷，无粘连和肉芽形成，但各层纤维组织增生紊乱，血管增粗；
术后12周双侧声带表面光滑，局部挛缩，声带瘢痕形成，固有层增厚，胶原纤维增多，排列紊乱，呈团状或束状，纤维间较多不规则间隙，血管和腺体少见或消失；
认为损伤后3个月声带瘢痕基本形成。张庆翔等[8]观察315例声带病变行CO2激光术后患者的声带及嗓音恢复情况，依据病变类型及范围行RemacleⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴa型声带CO2激光显微手术，每组63例，随访6个月以上；
结果表明：Ⅰ、Ⅱ型手术后声带形态及功能恢复较好；
Ⅲ型手术后声带的形态和功能部分恢复；
Ⅳ型及Ⅴa型手术后患者发声功能常难以恢复；
认为手术切除声带的范围与深度是影响术后声带自主修复的主要因素，如果手术不涉及声带肌，则具备恢复形态的框架和基础；
如果声带完全切除，则失去了恢复形态和功能的细胞和结构基础。张燚等[9]将30只实验犬随机分A(CO2功能1 W)、B(CO2功能3 W)、C(CO2功能5 W)、D(CO2功能8 W)、E(冷器械)5组，分别行Remacle I型声带CO2激光显微手术，观察到C、D组创面黏膜反应较A、B、E组重，创面愈合慢，可见病理性瘢痕；
在光学显微镜下计数单位面积内纤维细胞数量及毛细血管数量，C、D组明显高于A、B、E组；
在电镜下观察发现A、B、E组损伤较轻，声带修复过程无明显差别，而C、D组损伤较重，声带修复后固有层内弹力纤维稀少，胶原纤维明显增多；
认为采用低功率CO2激光(1～3 W)行声带上皮下切除术，组织修复结果与冷器械手术相似。Shen等[10]对早期声门型喉癌患者行声带CO2激光切除术，发现术后声带黏膜愈合过程在形态学上分为四个阶段：阶段1为创面暴露；
阶段2为渗出，于创面表面形成白色涂层；
阶段3为肉芽；
阶段4为稳定的黏膜。认为声带损伤在渗出和肉芽形成后120天内形成新生声带，此阶段内应密切监测随访行喉镜检查，若出现异常表现，如：复发性白斑、肉芽组织增生或愈合持续时间超过4个月，应考虑进行干预。

1.3声带低温等离子射频消融手术 低温等离子射频消融是一种新型微创手术技术，范围涵盖口腔及口咽癌、下咽癌以及喉癌等，此类手术患者的预后与既往开放手术及经口激光手术相当，但恢复更快、围术期及长期并发症发生率亦极低，且功能保留率极高[11～14]。

2012年Divi等[15]对犬进行喉部等离子射频消融手术，在术后0、4、7天摘取喉部观察，发现术后7天创面完全上皮化，未见声带肌肉的损伤，炎性反应比先前报道的CO2激光术后轻，表明该技术是去除声带病损组织的可行方法，可最大限度地减少瘢痕的形成。黄钧涛等[16]对低温等离子射频消融术和CO2激光手术治疗早期声门型喉癌效果比较的Meta分析表明，低温等离子射频消融术与CO2激光切除术都是治疗早期声门型喉癌的有效方式，相较于CO2激光，低温等离子射频消融术手术时间更短，术后嗓音恢复更好。

声带瘢痕主要是声带固有层内纤维组织沉积而成[17]，其形成影响了发声功能和嗓音质量。过度用声、炎性反应、特异或非特异性感染、咽喉反流、外伤、肿瘤、化学刺激等都有可能导致声带瘢痕的形成。而声带注射、声带病变术后、器械损伤及长期气管插管等使声带受到损伤，也可产生声带瘢痕[18]。王玲等[19]认为声带瘢痕形成的患者主要有2种表现：一是声音粗糙或出现复音，检查可见声带表面尚光滑，声门能闭合，但双侧声带振动不对称，局部振动僵硬或可见白色瘢痕区；
二是声音低弱，发声不能持久、乏力，检查可见声带局部白色瘢痕突起，声带呈弓形，声门闭合不全，声时缩短。根据声带瘢痕的深度及单双侧可分为四种类型[20]：①固有层萎缩伴/不伴上皮受累；
②上皮层、固有层和肌肉层均受到影响；
③声带瘢痕位于前联合处；
④声带全长瘢痕形成且嗓音质量明显变差。目前预防声带瘢痕形成的最好的方法是采用适当的喉显微外科技术和激光进行喉部手术。

3.1组织工程学在声带修复与再生中的应用 近几年来组织工程学在声带修复与再生的研究方向主要集中在模拟天然声带组织机械特性的生物材料、捕捉动态声带生物力学特性的生物反应器设计以及这些生物材料在体内外的应用。基于组织工程的基本原理，可注射的、有生物活性的和可生物降解的聚合物和水凝胶具有合适的化学成分、结构特征和特定的机械性能，已被广泛应用[21]。该材料比传统的材料植入更具有优势，因为其能在损伤部位固化成任何需要的形状，且能增强与周围正常组织的界面交锁；
该方法对患者的侵袭性和潜在创伤最小，限制了感染和继发瘢痕形成的风险，简单易行，患者易接受，降低了治疗成本[21，22]。

3.1.1透明质酸(HA)及其衍生物 HA是一种天然存在的糖胺聚糖，由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰D-氨基葡萄糖重复单元组成[23]，它是声带中含量最丰富的糖胺聚糖，每毫克总蛋白质中约有6 μg透明质酸(Hahn等，2008年)，将HA从声带中移除会导致声带硬度增加25%～40%(Chan等，2001年)。HA具有生物活性，并与细胞迁移和伤口愈合有关。细胞表面受体CD44(Turley等，1991年)和透明质酸介导的运动性受体(Krasinski等，2007年)与血凝素结合，启动炎症、细胞运动和细胞生长等级联反应，从而在伤口愈合和促进瘢痕形成过程中发挥重要作用[23]。鉴于HA可再生能力的前景，需要关注的是如何延长其短的半衰期，为了延长其停留时间，可通过功能化交联位点，如：取代HA骨干上的羧基或羟基。

Hylan B凝胶是天然透明质酸的衍生物，具有增强流变性、抗降解和促进结缔组织向注射部位生长的作用(Hallén等，1999年)。Jahan-Parwar等(2008年)采用CO2激光切除实验犬左侧声带黏膜层和固有层，4周后，4只犬左侧声带黏膜下注Hylan B凝胶，1只犬左侧声带黏膜下注射生理盐水，结果显示激光切除术后4周时，所有动物术侧声带均表现为软组织缺损和黏膜波消失，注射Hylan B的动物术侧声带黏膜波恢复，而注射生理盐水的动物术侧声带黏膜波仍消失；
注射12周后，注射Hylan B的犬声带组织再生、黏膜波恢复，而注射盐水的犬声带组织无再生，黏膜波仍消失；
组织学研究显示注射Hylan B的犬声带有残留的固有层，而注射生理盐水的犬术侧声带仅见致密的黏膜下瘢痕。该研究表明CO2激光切除犬声带后黏膜下注射Hylan B凝胶可在12周内恢复声带组织结构和黏膜波，并促进功能性组织再生；
Hylan B凝胶可作为软组织支架用于固有层缺损声带的发声功能修复。

HA天生存在于声带中，具有生物活性、生物相容性和非免疫原性，由于易于修饰，天然HA分子可以提供交联位点，根据交联程度和使用的浓度，其粘弹性和生物特性具有极好的可调性。多项研究表明HA支架可以支持声带组织再生，未来的研究应该着重于HA支架与细胞的结合，并根据患者的需要进一步细化调控其粘弹性，以提供充分和持续的组织再生功能。

3.1.2细胞外基质(ECM)衍生的天然材料 脱细胞化ECM支架可以保存原生组织微结构和ECM成分，为浸润细胞(如：干细胞、成纤维细胞等)提供物理和生化环境，以促进其良好的附着、生长和分化。ECM支架还可以保留对声带功能至关重要的固有力学性能，Huber等(2003年)进行了第一次异种移植物植入声带重建的研究，此研究使用脱细胞猪膀胱黏膜下层(UBS-ECM)重建犬喉部组织以替代手术移除的犬甲状软骨和声带，3个月后，观察到甲状软骨、上皮组织、结缔组织、腺体结构和部分骨骼肌的再生，但没有恢复到原来的位置，重建的组织在微观结构和宏观结构上与原始组织非常相似。因此，可以推测ECM的组织和成分决定了声带的振动特性，由于此支架是膀胱黏膜下层ECM的异种移植，声带功能不会完全恢复。2016年，Kitamura等[24]对犬行半喉切除术，术后植入猪膀胱黏膜下层脱细胞化细胞外基质(UBM)衍生支架重建喉缺损组织，虽然在支架植入后一周内有一只犬出现局部感染，但1个月内所有犬的创面均显示良好的再上皮化，并且并发症较少；
术后6个月对喉再生效果进行评价，约一半动物发声阈值压力和标准化黏膜波振幅为正常或接近正常。如前所述，膀胱黏膜下层异种移植物的使用可能会影响这些动物的声带功能，因此，声带特异性ECM可能是声带修复的理想选择。

3.1.3合成生物高分子材料 由于大多数用于声带损伤治疗的可注射非细胞生物材料快速的酶降解和注射后原生细胞补充有限，导致其再生潜力有限。针内压力和宿主免疫反应的作用，往往引起细胞凋亡。可降解微球可通过增加细胞停留时间、在注射过程中保护细胞、提供早期免疫应答保护来提高治疗效果。Reyes Valenzuela等[25]采用包裹人声带成纤维细胞(HVFF)的微球(Ms)作为声带固有层损伤后的靶向再生材料，制备了海藻酸钠、海藻酸钠-聚L-赖氨酸、海藻酸钠-壳聚糖微球，并对其生物相容性、溶胀性、力学性能以及细胞因子的产生进行了研究；
发现海藻酸钠微球的声带再生性能最理想，能抵抗机械损伤，并且具有类似于天然声带固有层的硬度，能增加成纤维细胞的增殖。

3.1.4生物反应器 生物反应器通过提供有利的条件，如：最佳的温度、压力、底物或支架支持、调节生化信号和物理化学刺激，为细胞和组织的体外发育提供一个可控的环境[26]。用于声带组织工程的可靠的体外模型或生物反应器必须包含四个精确控制的主要变量，即：频率、振幅、可编程振荡机制以及延长细胞生存能力的适宜环境。除了生物相容性外，这些系统中使用的材料还必须能够抵抗开关应力和摩擦能量耗散(Titze等，2004年)。通常有四种生物反应器：①基于扬声器的生物反应器；
②基于执行器的生物反应器；
③基于流变仪的生物反应器；
④基于气流和真空的生物反应器，生物反应器对于在体外复制声带的发声条件是必不可少的。迄今为止的研究主要集中在发展以执行器和扬声器为基础的生物反应器，以及少量基于流变仪和空气动力学的生物反应器。研究通过各种振荡机制将张力应用于细胞培养，涉及的频率范围为50～300 Hz，平面外位移为0.1～1.0 mm[27]。

3.2干细胞 干细胞应用的主要目的是恢复原生组织的生化特性，使细胞外基质得以重建，并恢复声带的振动和发声功能。主要使用的干细胞为自体和非自体内间充质干细胞(MSCs)、成纤维细胞、肌细胞、脂肪衍生的干细胞(ASCS)、人胚胎干细胞(HESC)和诱导的多能干细胞(IPSCS)[28]。国内胡蓉等[29]对34只实验兔的53侧声带进行声带锐性损伤，将自体脂肪间充质干细胞植入20侧损伤声带后，示踪观察脂肪间充质干细胞在声带固有层内的生长分布；
同时以单纯支架(胶原或透明质酸凝胶)植入18侧受损声带(胶原10侧，透明质酸8侧)及单纯损伤15侧声带作为对照组，术后15 d～12个月时采用HE染色、Masson染色、Alcian Blue染色及免疫组化染色观察声带形态学变化及声带固有层胶原、透明质酸、纤维连接蛋白的含量及分布变化；
结果表明脂肪间充质干细胞植入兔损伤声带后具有促进声带细胞外基质分泌、合理分布及部分有序化排列的功能，具有促进声带修复再生的作用。Long等[30]将兔脂肪来源的间充质干细胞(ASC)嵌入三维纤维蛋白凝胶中，形成细胞基质外声带替代物(COVR)；
16只兔切除单侧声带上皮及固有层，并采用纤维蛋白胶原、自体切除声带覆盖再植、COVR植入三种方法分别重建；
4周后，对喉部进行组织学检查和发声功能检查，结果表明兔声带切除术后植入COVR减少了瘢痕的产生，短期内发声时产生对称的黏膜波；
1个月后发声功能优于自体声带覆盖再植组。干细胞重建在乳腺癌中得到了最广泛的研究，也仍然存在极大的争议[31]；
一项对小鼠的研究发现，使用MSC增加了导管癌细胞的转移(Karnoub等，2007年)；
头颈部癌细胞株也出现了类似的结果[32]。因此在进行喉癌切除术后喉部重建的干细胞疗法之前，还需要更仔细的实验研究。

3.33D打印技术 3D打印技术具有易用性、可承受性、可用材料的多样性以及创建复杂结构的能力，该技术已被用于模拟喉切除术后的气管形态[33]和环状软骨的重建[34]。Goldstein等[35]描述了一种3D打印聚乳酸移植物，植入成熟软骨细胞用于喉气管重建。Romero等[36]选择并改进了一种3D打印技术，可以将紫外线固化液体硅胶嵌入凝胶状介质，3D打印出立方体并接受拉伸测试来验证其材料性能，然后打印出自振荡声带模型，涂上代表上皮细胞的薄层硅胶，用于发声测试，以收集开始压力、频率和振幅数据。显然，3D打印对声带修复再生有希望，但还需要进一步研究。

综上所述，不同手术方式、不同手术范围声带切除术后声带自主修复的过程有所不同，CO2激光切除术后3个月声带瘢痕基本形成，而手术范围与深度是影响声带术后自主修复的主要因素。近年来等离子射频消融手术开展越来越多，但对其具体术式暂无明确分类，对使用不同功率以及其损伤后不同时间段声带自主修复的机制也缺乏细致的研究。目前声带损伤后修复与再生的方法主要为组织工程学，但近年来已不局限于使用一种方法，因此应将组织工程学、干细胞、3D打印结合起来，构建综合治疗方案，进行更多的实验研究，以待能够临床应用于声带创伤的修复。