尿素含量测定方法的比较

李颖，刘雁鸣，郑金凤，谢莹莹，张悦，刘杨，蒋赟（1.湖南省药品检验检测研究院，长沙 410001；
2.湖南省药品审查核验中心，长沙 410209；
3.国家药品监督管理局药用辅料工程技术研究重点实验室，长沙 410001）

尿素又称碳酰胺、脲，在临床上作为脱水药、利尿药及角质软化药等；
由于该药具有抗菌，使蛋白质溶解、变性，增加蛋白质水合，增加皮肤通透性等作用，作为辅料在药剂中主要用作透皮促进剂及助溶剂，以增加药物在水中的溶解度[1]。同时，尿素还可用于注射剂、口服制剂和外用制剂[2]。由于药用尿素的广泛应用，其需求量逐年上涨[3]。需对其含量测定《中国药典》（ChP2020）、欧洲药典（EP10.0）和日本药典（JP17）中均采用氮测定法[4-7]，仅美国药典（USP43）中采用HPLC 法[8]。本文比较了凯氏定氮法、HPLC-CAD 法和HPLC-UV 法3 种测定尿素含量的方法，以寻找一种简便、有效、适用性高的方法。

1.1 仪器

凯氏定氮装置[4]；
U3000 电喷雾高效液相色谱仪（CAD 检测器，赛默飞公司）；
e2695高效液相色谱仪（UV 检测器，Waters 公司）；
MS105DU 电子天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）。

1.2 试药

尿素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100288-201903，纯度：99.8%）；
缩二脲（麦克林，批号：C10871148，纯度：98%）；
三聚氰酸（麦克林，批号：C10691090，纯度：98%）；
缩三脲（上海旭东海普南通药业有限公司，批号：190601，纯度：99.0%）；
乙腈（Merck 公司，批号：JA079030，色谱级）；
收集尿素样品9 批；
水为实验室自制超纯水。

2.1 溶液配制

2.1.1 盐酸滴定液（0.2 mol·L－1） 取盐酸18 mL，加水至1000 mL，摇匀。按照ChP2020年版通则8006 盐酸滴定液标定。

2.1.2 系统适用性溶液 精密称取缩二脲、缩三脲、三聚氰酸和尿素适量，用75%乙腈溶解并稀释制成质量浓度分别为0.005、0.005、0.005（约相当于0.1%的浓度）和5.0 mg·mL－1的混合溶液，即得。

2.1.3 供试品溶液 取本品，加75%乙腈溶解并稀释制成每1 mL 中含0.2 mg 的溶液，摇匀，即得。

2.1.4 对照品溶液1 精密称取尿素对照品90.51 mg，至10 mL 量瓶中，加75%乙腈溶解并稀释制成每1 mL 中含9.033 mg 尿素的溶液，作为对照品储备液。精密量取对照品储备液适量，用75%乙腈稀释制成质量浓度为 90.33、135.49、180.65、225.82、451.64 μg·mL－1的线性系列溶液。

2.1.5 对照品溶液2 精密称取尿素对照品约96.71 mg，至10 mL 量瓶中，加75%乙腈溶解并稀释制成每1 mL 中含9.652 mg 尿素的溶液，作为对照品储备液。精密量取对照品储备液适量，用75%乙腈稀释制成质量浓度为96.52、144.77、193.03、241.29、482.58 μg·mL－1的线性系列溶液。

2.2 凯氏定氮法

参考ChP2020 四部尿素各论[4]下的含量测定项进行测定。

2.2.1 重复性测试 取同一批供试品（批号：20180301）共6 份，按ChP2020 四部的条件进行试验，结果见表1。

表1 重复性结果表(%)Tab 1 Repeatability (%)

2.2.2 含量测定 本品在ChP2020 中的限度为：含CH4N2O 不得少于99.5%。第一次含量考察结果6 份样品有3 份未达到要求；
根据其原理及试验操作过程[9-13]，课题组认为是否消解完全会直接影响含量测定结果，第二次对尿素含量测定进行考察时，对上述可能存在的问题进行了排除。严格控制消解时火炉的火力大小，使样品一直处于沸腾状态，样品完全消解，结果均能符合限度要求，且滴定结果的平行性好（RSD＝0.26%）。

2.3 HPLC-CAD 法

2.3.1 色谱条件 色谱柱：Waters XBridge Amide（4.6 mm×250 mm，3.5 μm）；
流动相：乙腈-水（94∶6）；
流速：1.0 mL·min－1；
柱温：30 ℃；
电喷雾检测器雾化温度：35℃；
进样量10 μL。

2.3.2 系统适用性试验 取空白溶剂（75%乙腈）及“2.1”项下系统适用性溶液、对照品溶液及供试品溶液各10 μL 注入液相色谱仪，按“2.3.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图。结果空白溶剂对主峰无干扰，各杂质峰之间以及与尿素主峰之间的分离度均满足要求。典型图谱见图1。

图1 HPLC-CAD 典型色谱图Fig 1 Typical chromatogram of HPLC-CAD

2.3.3 线性关系试验 精密量取“2.1.4”项下线性系列溶液各10 μL，进样测定，记录色谱图，以质量浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，Y＝0.013X－0.5595，R²＝0.9997。结果表明，尿素在90.33 ～451.64 μg·mL－1内与峰面积的线性关系良好。

2.3.4 检测限和定量限 分别精密量取“2.1.4”项下对照品储备液适量，逐级稀释，精密吸取10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。设定量限S/N＝10，检测限S/N＝3，结果检测限为0.0020 μg·mL－1，定量限为0.0067 μg·mL－1。

2.3.5 精密度试验 取同一批供试品溶液（批号：20180301），连续进样6 次，测得尿素峰面积的RSD（n＝6）为0.56%，表明仪器精密度良好。

2.3.6 重复性试验 取同一批供试品（批号：20180301）共6 份，分别按“2.1.3”项下方法制备，进样测定，计算尿素的含量为99.11%，RSD为2.1%（n＝6），表明方法的重复性良好。

2.3.7 稳定性试验 取同一批供试品溶液，于0、2、4、8、12 h 分别进样测定，记录色谱图，测得尿素峰面积的RSD为4.2%（n＝5），表明供试品溶液在12 h 内稳定性良好。

2.3.8 回收试验 取同一批供试品（批号：20180301）共6 份，每份约0.25 g，精密称定，分别置于50 mL 量瓶中，加75%乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取0.5 mL，置25 mL 量瓶中，精密加入尿素对照品储备液（9.033 mg·mL－1）0.25 mL，加75%乙腈稀释至刻度，摇匀，作为回收率测定溶液，进样测定，计算尿素的平均回收率为99.15%，RSD为1.4%（n＝6），表明本方法的回收率良好。

2.4 HPLC-UV 法

2.4.1 色谱条件 色谱柱：Waters XBridge Amide（4.6 mm×250 mm，3.5 μm）；
流动相：乙腈-水（94∶6）；
流速：1.0 mL·min－1；
检测波长：195 nm；
柱温：30℃；
进样量：10 μL。

2.4.2 系统适用性试验 取空白溶剂（75%乙腈）、系统适用性溶液、对照品溶液及供试品溶液各10 μL 注入液相色谱仪，按“2.4.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图。结果空白溶剂对主峰无干扰、各杂质峰之间以及与尿素主峰之间的分离度均满足要求。典型图谱见图2。

图2 HPLC-UV 典型色谱图Fig 2 Typical chromatogram of HPLC-UV

2.4.3 线性关系试验 精密量取“2.1.5”项下的线性系列溶液各10 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，以质量浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，Y＝3.4385×103X＋1.9593×104，R²＝0.9996。结果表明，尿素在96.52 ～482.58 μg·mL－1内与峰面积的线性关系良好。

2.4.4 检测限和定量限 分别精密量取“2.1.5”项下对照品储备液适量，分别逐级稀释，精密吸取10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。设定量限S/N＝10，检出限S/N＝3，结果检测限为0.62 μg·mL－1，定量限为2.06 μg·mL－1。

2.4.5 精密度试验 取同一批供试品溶液（批号：20180301），按“2.4.1”项下的色谱条件连续进样6 次，记录色谱图，测得尿素峰面积的RSD为0.42%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.4.6 重复性试验 取同一批供试品（批号：20180301）共6 份，分别按“2.1.3”项下的方法制备供试品溶液，按“2.4.1”项下的色谱条件分别进样测定，计算尿素的含量为99.81%，RSD为0.35%（n＝6），表明方法的重复性良好。

2.4.7 溶液稳定性试验 取同一批供试品溶液（批号：20180301），于0、2、4、8、12 h 分别按“2.4.1”项下的色谱条件进样测定，记录色谱图，测得尿素峰面积的RSD为0.30%（n＝5），表明供试品溶液在12 h 内稳定性良好。

2.4.8 回收试验 取同一批供试品（批号：20180301）共6 份，每份约0.25 g，精密称定，分别置50 mL 量瓶中，加75%乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取0.5 mL，置25 mL 量瓶中，精密加入尿素对照品储备液（9.652 mg·mL－1）0.25 mL，加75%乙腈稀释至刻度，摇匀，作为回收率测定溶液，进样测定，计算尿素的回收率为100.09%，RSD为0.96%（n＝6），表明本方法的回收率良好。

2.5 样品含量测定

取9 批供试品，分别按照3 种不同的方法进行测定，运用SPSS 软件配对t检验对尿素含量的结果进行分析，结果见表2 及表3。

表2 含量测定结果(%)Tab 2 Content determination (%)

表3 3 种方法配对t 检验Tab 3 Paired t-test of the 3 methods

综上，3 种含量测定方法测得的结果基本一致，配对t检验结果显示P均小于0.05，表明3种方法间成显著相关。

本试验对尿素含量的测定方法进行了比较，结果表明采用3 种方法测定尿素含量测定结果基本一致，互相证明了3 种方法结果的可靠性。

传统凯氏定氮法测定尿素的含量，虽然成本低廉，但是操作过程烦琐，分析时间长，影响因素多，试验第一步消解为尿素与硫酸反应生成硫酸铵，凯氏烧瓶中的溶液在缓缓加热至溶液呈澄明的绿色，此时能明显观察到凯氏烧瓶中弥漫了白雾，火力需始终保持样品溶液在白雾中沸腾再保持加热30 min。此时，火炉的火力控制不当，样品消解不完全会造成含量偏差过大。火力太大，白雾会冲出凯氏烧瓶，无法使样品反应完全；
火力太小，样品达不到沸腾状态，也无法完全消解样品。另外，使用的定氮仪是采用通则0704 氮测定法的装置，该装置搭建烦琐，且该试验需要加热蒸馏，“俟氨馏尽”，这样的字眼在试验过程中不能简单明了地判断，接收馏液不全，直接影响样品的含量。此外，ChP2020 采用的氮测定法是对含氮量的测定，而非针对尿素主成分本身，因此该方法的专属性存在一定的问题，可操作性差。HPLC-CAD 法可排除缩二脲、缩三脲和三聚氰酸等杂质的干扰，专属性强，准确度与精密度均良好，简便易操作[14-15]；
但电喷雾检测器在市场上的普及率相对较低，仪器的维护成本较高。HPLC-UV 法既能准确地测定尿素的含量，还可以测定除尿素外的其他杂质含量，且仪器的市场普及率高；
综合考虑，认为HPLC-UV 法更能广泛地应用到尿素含量的测定中。本研究可为尿素及其相关产品质量标准的建立及开发提供理论依据。