脂肪细胞怎样才能凋亡 经ＲＮＡｉ诱导的前脂肪细胞构建组织工程化脂肪组织

　　[摘要]目的：应用基因工程和组织工程的原理和方法,通过改造人前体脂肪细胞，提高其活性后，于裸鼠背部皮下构建组织工程化脂肪组织。方法：采用原代消化细胞培养法培养出前脂肪细胞,利用RNAi技术，诱导前脂肪细胞内的一个重要凋亡调控基因Bax基因表达沉默,然后接种到聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)支架上,种植在20只雌性裸鼠皮下,对获得的脂肪组织进行组织学评价。结果：经过改造后的前脂肪细胞活性良好,术后裸鼠全部成活，前脂肪细胞能够在支架上良好的存活，生长和增殖。结论：经过改造后的前脂肪细胞具有良好的活性，并且PLGA- 前脂肪细胞复合体在裸鼠体内可形成脂肪细胞,值得进一步研究, 以探索治疗软组织缺损的新途径。
　　[关键词]RNAi；Bax基因；组织工程；脂肪组织
　　[中图分类号]Q813[文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2008）10-1479-04
　　
　　RNAi induced preadipocytes to build tissue engineering adipose tissue
　　ZHUANG Jian-hua1，ZHUO Yang2，ZENG Xing-ye2
　　(1.Department of Surgery, Lucheng People"s Hospital, Wenzhou 325000,Zhejiang,China;
　　2.Department of Surgery, the 118th Hospital of PLA)
　　
　　ObjectiveUsing genetic engineering and tissue engineering principles and methods, through the transformation of preadipocytes, enhancing its activity,and to construct tissue engineering adipose tissue in the back skin of nude mice.Methods Using primary-digest method to culture preadipocytes, using RNAi technology to induct an important apoptosis gene Bax gene expression silence in preadipocytes，and then inoculated into polylactic acid - glycolic acid copolymer (PLGA) scaffold , planted in 20 female nude mice, the adipose tissue was carried out histological evaluation. Results After ransformation, the activity of preadipocytes is good, after all the mice survived. preadipocytes can survive well in the scaffold, growing and proliferation.ConclusionsAfter ransformation, preadipocytes has good activity, and PLGA- preadipocytes can be formed fat cells in nude mice, it is worth further study to explore the treatment of soft tissue defects in new ways.
　　Key words：RNAi；Bax gene；tissue engineering；adipose tissue
　　
　　自体脂肪组织是修复各类组织缺损的最佳填充物，但体内脂肪组织一旦离开活体常易出现变性、坏死，如何获取活性脂肪细胞，是脂肪组织移植成功的关键。前脂肪细胞是一类能够增殖并向脂肪细胞分化的特异性前体细胞，为构建组织工程化脂肪组织的理想种子细胞。本研究从人体脂肪组织中提取人前脂肪细胞作为种子细胞，经体外培养扩增后，利用RNAi技术，诱导前脂肪细胞内的一个重要的凋亡调控基因Bax基因表达沉默,以促进前脂肪细胞的增殖和分化，抑制其凋亡，经上述处理的前脂肪细胞进行相关检测后，再和可降解人工细胞外基质（PLGA）混合培养，于裸鼠背部皮下体内构建组织工程化脂肪组织，以探索治疗软组织缺损的新的途径。
　　
　　1材料和方法
　　1.1可吸收性支架材料：研究采用的可吸收支架材料为PLGA材料，其主要技术参数为：PLA与PGA共聚物，两者单体的摩尔比为50:50，完全降解时间6～12个月，泡沫孔隙率为85%以上，孔径200～300μm。
　　1.2裸鼠及脂肪组织的来源
　　1.2.1动物实验用 BALB/C纯合雌性裸鼠20只,鼠龄 6～8周,由南方医科大学实验动物中心提供。动物存放在预先消毒的微隔离器里,再置于隔离室的层流通风窗内。裸鼠1鼠1笼放置 ,用消毒的专用饲料和水喂养。
　　1.2.2选取于本院行切疤植皮术的正常体重患者，年龄20～45岁，无其他急慢性疾病，切取腹部正常皮下脂肪组织。
　　1．3 方法
　　1.3.1 原代培养：术中切取皮下脂肪组织，PBS洗涤，去除脂肪组织中肉眼可见的纤维及血管成分，剪切约20min，使之成为约0.5～1mm3的小组织块，以1000r/min离心10min，取上层纯脂肪颗粒，加入1%胶原酶，置于37℃,体积分数5%CO2培养箱内消化15h，再以1 500r/min离心3～5min，弃去上层漂浮的脂肪细胞和培养液，沉积的细胞用基础培养基制成细胞悬液，反复吹打使之混合均匀，150μm尼龙网过滤，PBS洗涤并离心，吹打均匀，接种于35mm培养皿内，接种密度为每平方厘米1×104～2×104个细胞。培养皿内加入适量含20%胎牛血清，青、链霉素浓度均为100U/ml的全培，混合均匀，置于37℃，5%CO2孵箱内孵育，每天观察，2～3天换液。
　　1.3.2 细胞传代：当细胞生长接近单层汇合1/2时即进行常规传代培养。以0.25%胰蛋白酶＋0.03%EDTA进行消化，于室温下消化约1min，在倒置显微镜下观察见胞质回缩、细胞间隙增大，立即吸出消化液，加入适量培养基，用吸管将细胞吹打下来，按1传2的比例进行传代，当传代细胞生长接近单层汇合70%时，可继续传代。
　　1.3.3引物、siRNA模板设计及siRNA合成
　　1.3.3.1在GenBank中查找到人Bax基因mRNA(gi:34335114)：用PrimerPremier5.0软件设计引物,Bax-sense:5′-gcttcagggtttcatccagg-3′,Bax-antisense:5′-tgtc cacggcggcaatca-3′,扩增片断176bp。同源性检验未发现在 GenBank中有其它同源序列。应用Ambion公司靶点搜寻工具并结合RNAstructure分析结果,Bax基因mRNA抑制靶点选在130、131aa二联碱基开始的5′-gacaggggcccttttgctt-3′,在序列3"端加上T7启动子互补序列-cctgtctc，得到转录模板。siRNA合成遵照SilencerTMsiRNAConstructionKit说明书进行。
　　1.3.3.2转染混合物制备：用无血清无双抗的DMEM稀释siRNA和转染试剂,并将后者缓慢滴加入前者,siRNA和转染试剂质量比为1:15,混合物室温孵育备用。
　　1.3.3.3实验分组及细胞转染：待前脂肪细胞生长至60%～70%时,换转染混合物的培养液2ml，36h后测Bax基因表达水平。
　　1.4 经过转染后的前脂肪细胞培养
　　将PLGA切成5mm×5mm×0.5mm正方形小块放入培养皿中，分别75%酒精浸泡消毒2h, 双抗浸泡过夜，无菌PBS浸洗3遍，然后置入90mm无菌培养皿中干燥,用时再紫外线照射30min。实验分2组 ,每组20个标本，Ⅰ组(实验组): 将20个标本置于24孔培养板中，滴加适量含20%FBS DMEM于37℃、5%CO2培养箱内预湿过夜，以增加其亲水性，取1ml经酶消化的2×105/ml单细胞悬液置于PLGA海绵支架上，再加入2ml10%FBS DMEM培养液使其均匀分布；Ⅱ组（对照组）:将未接种细胞的单纯支架材料滴加适量含20%FBS DMEM于37℃、5%CO2培养箱内预湿过夜, 再加入2ml 10%FBS DMEM培养液，两组静置培养72h。
　　1.5 动物实验方法：20只裸鼠按实验分组,在裸鼠背部左右两侧用75%酒精消毒,于两肩胛骨处各作一0.5cm切口,潜行分离形成皮下腔隙，将体外培养的两组支架材料共40个样本，于每只鼠背部皮下植入2个复合体（左侧为I组，右侧为II组），切口用5-0丝线缝合，伤口涂酒精后裸露,术后不用任何抗生素。裸鼠转入各自笼内饲养后,每天观察,在预定时间内切开背部皮肤，切取植入物，迅速置于10%甲醛或2.5%戊二醛中固定,以待进一步处理后作光镜或电镜检查。
　　
　　2结果
　　2.1 原代培养前脂肪细胞的形态学观察：接种后细胞在数小时后贴壁，初为类圆形，细胞大小不等，核/浆比例较大，细胞核几乎充满胞浆。2～4天即逐渐伸展开，大多数细胞为长梭形，两端尖细，尖端可延伸很长，有的细胞为多角形，立体感较强，胞浆内可见数量不等的线粒体，核椭圆形，较大，核仁较清晰（图1）。2～3周可形成内含大小不等脂滴的多脂滴脂肪细胞，脂滴更可汇合形成单脂滴脂肪细胞，含脂滴细胞逐渐增多，最终可达到80%以上（图2）。
　　2.2 siRNA-Bax对前脂肪细胞Bax基因表达水平的影响（图3）：从图中可以看出，阳性对照组中Bax基因表达水平明显比阴性对照组要弱，说明siRNA-Bax对前脂肪细胞Bax基因表达水平起到了明显的抑制作用。
　　2.3 培养的前脂肪细胞生长特性观察：扫描电镜观察：PLGA材料均为珊瑚状多孔结构，气孔多为连通气孔，气孔分布为大孔-微孔结构，其中大孔孔径为200～300μm，相互连通，在大孔孔壁上分布着孔径5μm以下的微孔（图4）。与细胞共孵育1周后，可见细胞呈椭圆球形或不规则形，紧密粘附于PLGA支架表面，细胞与材料及细胞间有丝状纤维形成。
　　2.4移植物的生长特性观察 术后裸鼠全部成活，完成实验观察。
　　2.4.1大体观察：种植后伤口及种植区未见感染和种植物排出。第2周时,裸鼠两肩胛区可各触及有一皮下结节,推动该处皮肤，结节可同时活动，植入物同表面皮肤结合紧密，与底部肌肉组织结合疏松。切开皮肤，见植入物形状改变，左侧由原来的正方块变圆变光滑，呈“鹅卵石”样，有包膜覆盖，包膜上有丰富小血管网，主要来自裸鼠皮肤，移植物的大小同植入前无明显差别。右侧移植物同植入前无明显差别,有包膜覆盖,包膜上无小血管网。第4周时, 左侧移植物体积较植入前大，右侧移植物体积较植入前小,切开皮肤，左侧继续变扁变光滑，有包膜覆盖，来自裸鼠皮肤的血管进入包膜 ,然后广泛发出分枝，质地变软。右侧开始萎缩，表面有包膜覆盖,包膜上无小血管网，质地变软（图5）。
　　2.4.2 电镜观察：I组第2周，扫描电镜可见前脂肪细胞在PLGA纤维上贴附生长, 部分细胞为长梭形,伸展良好,另一部分细胞为球形，未伸展开，另外可见部分小的球形细胞，可能为裸鼠的淋巴细胞。I组第4周，扫描电镜见细胞呈扁平多角形或圆形，细胞数量明显增多，呈聚集性分布，细胞周围有大量基质，表明前脂肪细胞在支架上粘附、伸展和生长良好（图6）。II组第4周，透射电镜下见材料孔洞变大，不光滑，连续性不明显，有崩解现象。
　　
　　
　　
　　3讨论
　　因先天性畸形、外伤及头、颈、四肢的肿瘤切除术等各种原因所引起的全身各部位的组织器官的缺损不仅造成了外形上的缺陷，而且会引起不同程度的功能障碍，给患者的心灵带来了巨大的伤害。自体脂肪组织是修复各类组织缺损的最佳填充物， 但如何保持移植脂肪组织生物活性一直是整形外科学界及所有修复外科面临的重要难题之一。体内脂肪组织一旦离开活体常易出现变性、坏死，如整形外科最常见的小颗粒脂肪移植术，常因脂肪组织耐受组织缺氧能力差而出现坏死，究其原因是常规的整形技术是将供区数以万计或十万计脂肪细胞团块即时移植至受区，由于营养障碍，大量移植脂肪细胞坏死，即使部分细胞成活，该成活脂肪细胞仍无扩增现象，极易褪化，移植后数月逐渐丧失脂肪细胞特性，由成纤维细胞逐渐替代[1-2]。如何保持其旺盛扩增状态，维持其脂肪细胞特性，是脂肪组织移植成功的关键[3]。
　　组织工程学(tissue engineering)是近10多年提出的新概念，它是应用细胞生物学和工程学的原理，研究开发修复、改善损失组织结构和功能的生物替代物的一门科学。其基本原理和方法是将体外培养和扩增的正常组织细胞吸附于一种生物相容性良好并可被机体降解吸收的生物材料上形成复合物，将细胞生物材料复合物植入机体组织、器官的病损部分，细胞在生物材料逐渐被机体降解吸收的过程中形成新的形态和功能方面与相应器官、组织相一致的组织，从而达到修复创伤和重建功能的目的。组织工程一经提出，就受到各国学者的重视，组织工程发展至今已取得了丰硕的成果，目前已在软骨、骨、皮肤、肝脏等领域取得可喜的进展[4-5]，某些组织已进入临床应用。生物可降解材料是组织工程研究中主要采用的材料 ,有聚乳酸 (polylatic acid,PLA),聚乙醇酸(polyglycolic acid,PGA)和它们的共聚物 (PLGA)，聚丁酸(polyhydroxybutyrate,PHB)等，这些可吸收的ECM（extral cell material）已获得美国FDA的批准,可应用于人体内。组织工程化的脂肪组织构建为解决上述问题提出一条新的思路。
　　种子细胞为组织工程的主要基本要素，脂肪细胞系由起源于中胚层的多能干细胞逐步分化、发育而成,其过程大致为:多能干细胞→间充质前体细胞→前脂肪细胞→成熟的脂肪细胞。前脂肪细胞(preadipocyte)是一类能够增殖并向脂肪细胞分化的特异化的前体细胞，由于前脂肪细胞不含脂滴 ,体积小,有促血管生成特性,在细胞的收集与移植过程中比成熟的脂肪细胞更能耐受缺血与创伤,尤其在脂肪移植后的缺血期,使单个细胞比块状脂肪更易通过细胞融合而成活，而且前脂肪细胞在常规培养条件下即可生长(目前已可以常规培养人、鼠及猪的前脂肪细胞 ) [6],使其有可能成为构建组织工程脂肪组织的理想种子细胞。但由于前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化的影响因素较多，且作为脂肪组织工程基本要素的种子细胞即前脂肪细胞在体外培养过程中，细胞极易老化，从而丧失增殖和分泌基质的能力，如何防止细胞老化和获得足量的细胞来源，是首先要解决的关键问题，而要解决这些问题，将组织工程与基因工程有机地结合，无疑是最有效的途径。
　　众所周知，Bcl-2与Bax是 Bcl-2基因家族中功能相反的两个重要成员,分别具有抑制和促进细胞凋亡的作用，Bcl-2与Bax的比值被认为是决定细胞生死存亡的关键点之一。据报道，肥胖大鼠棕色脂肪细胞处于产能静止状态,Bcl-2与Bax比值下降,细胞凋亡多,冷刺激或用肾上腺素处理后,该比值升高,细胞凋亡减少[7]。
　　RNAi是最近几年发现和发展起来的新兴的基因阻断技术.近年来的研究表明,一些小的双链RNA可以高效、特异的阻断体内某些基因致使mRNA降解,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型,称为RNA干扰(RNA interfenence,RNAi)。由于RNAi具有高度的序列专一性和有效的干扰活力,可以特异地使特定基因沉默,获得功能丧失或降低突变,它可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具,将功能未知的基因的编码区(外显子)或启动子区以反向重复的方式由同一启动子控制表达，这样在转基因个体内转录出的RNA可形成dsRNA,产生RNA干涉 ,使目的基因沉默。Lassus P等人[8]研究证明RNAi技术作为一种实用工具,诱导哺乳动物细胞内的基因表达沉默,使得许多以前我们无法运用传统的功能基因组学的技术方法研究的机制和模型成为可能,开创了研究基因和蛋白质功能的新天地。
　　本研究从人体脂肪组织中提取人前脂肪细胞作为种子细胞，经体外培养扩增后，利用RNAi技术，诱导前脂肪细胞内的一个重要的凋亡调控基因Bax基因表达沉默,以促进前脂肪细胞的增殖和分化，抑制其凋亡。经上述处理的前脂肪细胞进再和可降解人工细胞外基质（PLGA）混合培养，于裸鼠背部皮下体内构建组织工程化脂肪组织获得初步成功，为以后探索治疗软组织缺损的新的途径打下坚实的基础。
　　
　　[参考文献]
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　　[2]Stashower M, Smith K, Williams J, et al.Stromal progenitor cells present within liposuction and reduction abdominoplasty fat for autologous transfer to aged skin[J].Dermatol Surg,1999,25(12):945-949.
　　[3]马 乐，郭 杰.自体颗粒脂肪移植存活率的基础研究进展[J].中国美容医学,2005,14(3):375-377.
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　　[6]Wagoner B, Hausman DB, Harris RB. Direct and indirect effects of leptin on preadipocyte proliferation and differentiation[J].Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2006, 290(6):1557-1564.
　　[7]Sakahira H,Enari M,Nagata S. Cleavage of CAD inhibitor in CAD activation and DNA degradation during apoptosis[J].Nature,1998,391(6662):96-99.
　　[8]Lassus P, Rodriguez J, Lazebnik Y.Confirming specificity of RNAi in mammalian cells[J].Sci STKE,2002(147):PL13.
　　
　　[收稿日期]2008-07-11[修回日期]2008-09-27
　　编辑/张惠娟