低强度脉冲超声刺激对人类牙周膜细胞BMP-2表达效应的研究|Vector超声牙周仪

　　[摘要]目的：探讨一定强度的LIPUS对H-PDLCs进行辐照后，细胞内BMP-2的表达变化，对LIPUS诱导牙周成骨效应进行初步评估。方法：体外培养H-PDLCs，LIPUS（90mW/cm2，20min/天）连续处理1周，分别于处理1、3、5、7天后收集标本，同期培养的未接受任何处理的H-PDLCs为对照组。实时定量PCR检测各时间点细胞内BMP-2基因表达变化，2^（-△△CT）法分析基因相对表达变化量，对△CT值组间差异进行方差分析。结果：实时定量PCR显示LIPUS处理后H-PDLCs内BMP-2表达逐渐增强，于第3天达高峰，第5天逐渐减弱，但表达仍高于同期未处理组，到第7天下降到接近同期未处理组水平。尤其是，LIPUS处理3天后较同期对照组BMP-2基因表达增加6.07倍；5天后较同期对照组BMP-2基因表达增加2.30倍，△CT 值组间均具有统计学差异（P 　　
　　1材料和方法
　　1.1 主要材料与设备：改良型α-MEM培养基（美国Hyclone公司）；胎牛血清（美国Hyclone公司）；BMP-2引物（大连TaKaRa公司合成）； RNAiso Plus裂解液（大连TaKaRa公司）；SYBR Premix Ex Taq TMⅡ（大连TaKaRa公司）；dNTP Mixture（大连TaKaRa公司）；Random Primer 6mer（大连TaKaRa公司）；Ribonuclease Inhibitor（大连TaKaRa公司）；M-MLV Reverse Transcriptase（美国Promega公司）； DEPC（美国Bio Basic Inc公司）；六通道LIPUS换能器由重庆医科大学超声医学工程中心提供；荧光定量PCR仪Rotor-Gene 6000实时定量核酸扩增系统（澳大利亚Corbett Life Science公司）。
　　1.2 h-PDLCs体外培养：人类牙周膜标本来自重庆医科大学附属口腔医院颌面外科门诊，在征得患者及家长同意下收集12～20岁健康青少年因正畸需要拔除的双尖牙。无菌条件下，用含双抗（青霉素、链霉素）浓度为100单位/ml的PBS液反复冲洗洗牙齿去污和灭菌，直至牙齿和冲洗过的PBS液不再有血污。此时将洗净的牙齿移人另一无菌培养皿中，滴加少许含20%胎牛血清的DMEM培养液，保持根面湿润。用无菌刀片反复纵横切割根中l/3的牙周膜组织，仔细进行刮除，使组织块小于1mm×1mm×1mm。将刮下的组织碎屑用含双抗的PBS液漂洗2次，吸除多余水分。用无菌口腔探针小心将组织块以均匀间距接种于六孔板底壁上，滴加少量含20%胎牛血清α-MEM培养基，置CO2培养箱(5% CO2、95%空气、l00%湿度，37℃恒温)孵育，隔夜后再加将培养基补至约1.5ml。待原代细胞长满单层后进行传代， 0.125%胰蛋白酶进行消化，约3～5min后细胞间隙增大，胞体回缩变圆。此时加入含10%胎牛血清的α-MEM终止消化，轻轻拍打瓶壁使细胞从瓶壁上脱落下来，并用吸管吹打均匀形成细胞悬液，转移细胞悬液入离心管，1 000rpm×5min离心后弃去上清液，加入适量培养基充分吹打，按1:2比例传代接种于细胞培养瓶中。
　　1.3 LIPUS处理及RNA提取：取第4代H-PDLCs接种于六孔细胞培养板，对应六通道LIPUS发射仪，采用通过超声耦合剂作为媒介的辐照方式。设定LIPUS参数频率：1.0～1.5 MHz；脉冲重复频率：1.0kHz；脉冲占空比：1:5；幅宽：200μs；输出强度90mW/cm2；辐照时间：20min/天。连续处理1周，分别于处理第1、3、5、7天后提取细胞RNA。
　　使用RNAiso裂解液提取总RNA。弃去细胞培养基，用PBS漂洗2遍。每孔中加入1ml的RNAiso裂解液，轻轻摇晃使其与细胞其充分接触，然后静置5min。移液枪充分吹打使细胞脱落，转移至1.5mlEP管中。向裂解液中加入200μl氯仿，盖紧EP管盖，用力震荡，使溶液充分乳化，静置5min。12 000g，4℃离心15min。此时液体分为三层，无色透明上清层为RNA，白色中间层为蛋白质，粉红下层色为无机层。小心吸取上清层，移至新的1.5mlEP管中。（注意勿吸出白色中间层)向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒EP管充分混匀，静置10min。12 000g，4℃离心10min。弃上清，管底见少量白色沉淀物质，即为RNA。无水乙醇和DEPC水现配成75%的乙醇1 000μl，洗涤RNA沉淀。12 000g， 4℃离心5min。小心弃去乙醇，保留沉淀，在空气中气干3～5min。加入DEPC水溶解RNA。
　　1.4 实时定量PCR检测：取2μg总RNA，加入0.5μg引物6聚体，加DEPC水补足体积15μl。混匀后上RT-PCR仪进行逆转录，设置程序为70℃，5min。第一步完成后取出EP管立即冰浴，稍离心。加入试剂M-MLV 5×buffer 5μl，dNTP 2.5μl，M-MLV RT 1μl，Ribonuclease Inhibitor0.625μl，DEPC水补足至总体积25μl。程序设置为37℃，60min→4℃延伸。
　　c-DNA制备完成后，进行实时定量PCR检测。加入反应体系SYBR Premix Ex TaqTMⅡ12.5μl，cDNA1.0μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，ddH2O 10.5μl。程序设定：95℃预变性30s；95℃，10s；退火温度54℃，30s；72℃，30s； 45个循环。PCR引物合成序列见表1。实时定量PCR扩增曲线见图1，实时定量PCR溶解曲线见图2。
　　1.5 统计分析：采用SPSS 13.0统计软件对△Ct值组间差别比较进行方差分析。采用2^（-△△CT）法对BMP-2扩增结果ct值进行相对定量分析。
　　
　　2结果
　　2.1 LIPUS处理对H-PDLCs内BMP-2基因表达的影响：实时定量PCR结果显示，LIPUS处理后H-PDLCs第1天、3天、5天、7天BMP-2表达均有不同程度增高。以同期培养的未受LIPUS处理的H-PDLCs为对照，其中处理第1天，△Ct值处理前后组间无差异（P>0.05）；处理第3天BMP-2表达增加6.07倍，△Ct值处理前后组间差别具有统计学差异（P0.05）。
　　2.2 人类牙周膜细胞受LIPUS刺激后BMP-2基因表达的时间变化趋势：LIPUS对H-PDLCs处理后的第1天BMP-2增加不明显，处理后第3天，BMP-2表达明显升高，相对空白组增加6.07倍，而后开始下降，在处理后第5天BMP-2相对表达下降至2.30倍，在第7天回到初始水平。BMP-2表达水平见图3。
　　
　　3讨论
　　LIPUS指强度在100 mW/cm2 以下的脉冲式超声波，在两个脉冲之间有较长的间歇时间，相对产热较弱，不具侵入性[4]。以往大量研究证实LIPUS可有效促进新鲜骨折愈合、治疗骨不连等[9-10]，系安全无创的骨损伤辅助修复手段，于1994年和2000年经美国食品与药物管理局(FDA)批准将其用于促进新鲜骨折和骨不连的治疗[11]。基于LIPUS的促进骨组织改建的生物学效应，Ikai[12]利用LIPUS（30mW/cm2、1.5MHz、200μs）处理Beagle犬前磨牙急性牙周骨质缺损20min/D，4周后发现实验侧的新生牙骨质和牙槽骨明显增加，牙龈上皮热休克蛋白70表达增加，这表明LIPUS可促进牙周损伤的修复和骨质再生。2010年，研究组前期实验也发现LIPUS对Beagle犬牙槽骨缺损具有潜在的修复效应[13-14]。
　　牙周组织修复不仅仅骨质再生，更重要的如何促进牙周膜细胞成骨分化。一般而言，机械刺激调节牙周膜细胞内某些具有成骨特性的生长因子如BMPs以引起细胞成骨应答，从而产生各类成骨效应指标诸如ALP、OC、OPN等的表达。BMP-2是目前研究最为广泛、诱导成骨活性最强的骨形成蛋白BMPs之一。早在1988年人们首次纯化分离出天然BMP-2[15]，此后还利用基因重组技术表达出人类基因重组rh BMP-2[16]。它能被反应细胞所感知，通过激活或抑制相关基因，调节骨系细胞的分化和增生。在骨形成早期，BMP-2可使具有成骨分化潜能的细胞向骨形成中心聚集，分化为骨系细胞；对于成骨细胞，BMP-2则可使之维持其特有细胞表型，并诱导成骨细胞标志物的增高，促进细胞外基质钙化，参与骨的再生[17]。
　　因此，本研究观察一定强度的LIPUS处理人牙周膜细胞一周后BMP-2基因表达变化，探讨LIPUS促牙周组织成骨分化效应。以同期培养的人牙周膜细胞作为对照，发现LIPUS可明显提高BMP-2表达，处理第1天未见统计学差异（P>0.05）；处理第3天BMP-2表达提高6.07倍，具有统计学差异（P