日本毛囊再生技术2018 [毛囊干细胞及其分离与识别方法的研究进展]

　　 干细胞是指未成熟细胞，具有自我更新和分化能力，可分化为胚胎干细胞和成体干细胞、其他细胞、组织及器官[1] ，胚胎干细胞是最有应用价值的干细胞，但由于来源于胚胎，进行相关研究和治疗必然涉及伦理和道德问题,所以胚胎干细胞的研究受到限制，而来源于同体的成体干细胞就不存在这种限制。皮肤组织更新速度快、再生能力强，因此，来自皮肤局部的干细胞受到了重视。研究表明，毛囊干细胞( hair follicle stem cells ,FSC)能分化成毛囊、皮脂腺、表皮，是皮肤组织工程理想的种子细胞，已成为目前的研究热点。现就毛囊干细胞及其分离与识别方法的研究进展综述如下。
　　
　　1毛囊的解剖特点
　　
　　毛囊是表皮向真皮中凹陷后形成的特殊结构,位于毛发下段。毛囊内外由上皮性毛根鞘和毛囊周围鞘两部分组成, 两者之间有玻璃膜。它包围着毛根,上面附有立毛肌,亦与皮脂腺相连，其最外层被毛囊周围鞘围绕。上皮性毛根鞘起源于表皮, 又分内根鞘和外根鞘。外根鞘相当于表皮的基底层和棘细胞层。毛囊可分为上下两部, 上部也称为恒定部即毛囊的上段,可再分为漏斗部和峡部，在峡部末端外毛根鞘细胞增殖,并且形成隆突区(bulge), 成为毛发上段的标记。该隆突部位可环绕整个峡部末端或仅限于单侧即立毛肌附着处, 目前被认为是毛囊干细胞存在的主要部位。在毛囊的周期性生长过程中,这部分保持稳定,不发生凋亡和再生。下部也称为循环部，可再分为球部和茎部,包括隆突部以下的毛囊和毛球。在毛囊的周期性生长过程中,这部分呈现出生长、衰退、静息和脱落的形态变化。根据循环部的变化,毛发再生过程中[2],毛囊依次经历生长期、退化期、静止期及脱落期，完成一个生长周期,毛囊周期生长是由毛囊干细胞和间质细胞的共同作用完成的。
　　
　　2毛囊干细胞的定位
　　
　　目前普遍认为毛囊干细胞定位于毛囊上段的隆突区。1990 年，Cotsarelis 等[3]采用连续[3H]-T 标记发现小鼠皮肤、睫毛、触须的毛囊球部并未见标记细胞及干细胞指征,但在隆突区可见,相反应用脉冲[3H]-T标记则发现标记物布满毛母质,而隆突区未见,于是提出“隆突激活假说”(bulge activation hypothesis) 。此后,Taylor 等[4]采用BrdU 和[3H]-T 双标记方法亦证实毛囊干细胞定位于上段的隆突区。在体外培养实验中,将生长期小鼠毛囊横切成四部分进行分段培养,发现95%的克隆形成细胞来自于含有隆突区的片段,其余少数克隆来自于毛球部[5]；培养人毛囊细胞,亦发现克隆形成细胞主要出现在外根鞘中段,近似于立毛肌附着点[6]。尽管越来越多的人赞同决定毛囊下段周期性生长的干细胞定位于隆突区,然而利用干细胞慢周期特性和毛囊生长周期特点对人毛囊进行体外分析,结果发现人毛囊干细胞在胚胎期定位于隆突区,而在成人则定位于毛囊下段-隆突区以下的外根鞘中[7]。应用毛囊干细胞特征标记物角蛋白19(keratin 19,K19) 进行检测亦可见阳性细胞出现在隆突区和毛囊下段两个区域[8],这意味着毛囊中可能有两个干细胞储存库,或者是在个体发育过程中早期细胞发生了下移的结果。此外，不同物种或同一物种的不同部位毛囊干细胞的定位都有所不同，如在手足部位,这些干细胞存在于表皮网状嵴的深层,而在头皮部位则定位浅表或位于表皮嵴的顶部及立毛肌附着的毛囊隆突区[9]。因此人类毛囊干细胞的确切定位尚有争论,这妨碍了人们理解毛囊干细胞在上皮生物学、创伤愈合以及肿瘤发生中的作用。
　　
　　3毛囊干细胞的分离及纯化
　　
　　许多研究者采用不同的方法试图将毛囊干细胞分离出来,以进行更深入的研究，目前对毛囊干细胞分离及纯化有以下几种方法：
　　3.1荧光标记细胞激活技术也称为流式细胞仪分选：这种方法可将带有一种或几种荧光标记的细胞分选出来,原理科学,操作方便,被众多研究者采用。2004年，Fuchs等[10]利用该技术从毛囊隆突部纯化出了毛囊干细胞,这种方法的优点是准确,但标记细胞体外培养活力不好,不容易传代培养。
　　3.2应用酶消化法[11]：将皮肤样本剪成小条,分离酶（dispase）低温消化后镜下切取毛囊隆突部,置于胰酶中37℃消化后1000r/min离心收集细胞加无血清的DMEM条件培养液培养，每3天换液。消化法分离的毛囊干细胞纯度较高，细胞分布均匀,细胞克隆形成能力强,增殖迅速被普遍应用于毛囊干细胞的初步分离，但获得的干细胞经历倍增期后,生长速度减慢,进入平台期，其原因可能是酶消化破坏了干细胞与微环境的联系；有研究表明[12]，在应用分离酶消化的过程中37℃消化2h，较以往4℃消化12h缩短了消化时间，能避免干细胞损伤。
　　3.3组织块法分离毛囊隆突部干细胞[13-14]：将皮肤切成0.2cm×0.2cm大小的小块,按表皮面朝上贴于玻璃平皿中,每皿3～4 块,加适量培养液，氢化可的松+青链霉素100U/ mL,置于CO2培养箱(5%CO2,饱和湿度,37℃)中培养,每两天换液一次。组织块法分离得到的毛囊干细胞纯度低于消化法，细胞生长比率低,细胞不易融合。但获得的干细胞历代倍增后仍处于增殖态势，其原因可能是从组织块中迁移出来其他种类的细胞可为干细胞营造一个类似于体内的微环境,使干细胞受到的损害小。
　　3.4差速贴壁法纯化毛囊干细胞[15-16]：应用酶消化法分离得到细胞后离心收集细胞接种于IV 型胶原包被的培养皿中。收集上层未贴附角质形成细胞和毛囊真皮成纤维细胞于另一皿中培养, 培养液为20%血清的DMEM ,每2天换液,收集条件培养基。贴附皿底的毛囊干细胞加无血清的DMEM条件培养液培养，每3天换液。克隆形成试验证实分离出来的干细胞纯度大于90% ,克隆形成能力最强的细胞粘附到Ⅳ型胶原等细胞外基质的速度最快[17]。此法将酶消化法得到的细胞进一步纯化，得到纯度高的毛囊干细胞，目前被普遍应用。
　　3.5显微分离技术分离纯化毛囊干细胞[18]:将皮肤样品置入分离酶中4℃消化。从脂肪端拉出毛囊，收集形态完好且处于生长期的毛囊，体视显微镜下切取毛囊隆突部，含双抗磷酸盐缓冲液漂洗3次，加入DMEM/F12补充培养基于37℃、5%CO2孵箱中培养，每3天换液。此法利用解剖学获取毛囊干细胞富集区对毛囊干细胞进行分离。但获得的毛囊干细胞纯度不高。
　　3.6联用显微分离培养与免疫磁珠法[19]：显微分离培养获得毛囊隆突区细胞，应用免疫磁珠纯化毛囊隆突区细胞中CD200阳性的毛囊干细胞可获得高纯度毛囊干细胞，且细胞活性不受影响。1990 年，Morris等[20]应用密度梯度离心方法分离小鼠表皮干细胞。因为用这种方法不能得到高纯度的干细胞,后来很少有人再采用这种方法。
　　
　　4毛囊干细胞的识别
　　
　　4.1毛囊干细胞的组织学形态特征：毛囊干细胞在光镜下呈立方形,细胞体积小,核浆比大,表面光滑,皱折少,又被称为非锯齿形细胞,细胞体积的增大与增殖能力呈负相关。超微结构显示胞内含有大量游离核糖体而缺乏角蛋白纤维,细胞表面有少许微绒毛,细胞核存在许多卷曲,染色质弥散分布,明显不同于周围的细胞,这些形态特征均表现出原始细胞的特性。倒置显微镜下观察可见培养早期的细胞呈圆形,折光性强,表现为铺路石状；细胞大小一致,核大而明显,多偏居于细胞一侧,可见双核细胞及分裂相细胞。细胞之间连接紧密,明显分层,随后增殖的细胞亦表现相同的形态。培养2周后,远离组织的细胞形态发生改变,逐渐伸长呈椭圆形,继续培养可见细胞皱缩,胞浆内出现黑色颗粒及细小空泡,细胞折光性降低,并有细胞裂解、死亡。
　　4.2标记滞留细胞：毛囊干细胞最重要的特点之一就是慢周期性,而且可以有无限多次细胞周期[2]。当暴露于带有其他标记的核苷酸例如[3H]-T 或BrdU时,细胞在DNA 合成的过程中摄取标记核苷酸而将标记整合于DNA中。4～8 周后快速分裂的短暂增殖细胞(transit amplifying cells,TAC)丢失了大量标记,而由于干细胞的细胞周期长,这样的标记可以维持相当长的一段时间,因此有人称它为标记滞留细胞(label-retaining cell,LRC),是迄今为止识别毛囊干细胞最可靠的方法之一。这种方法由Bickenbach[21]1981年首先提出,现已成为公认的识别毛囊干细胞的方法,并被当作探索新的识别方法的参照标准。
　　4.3细胞克隆形成率：毛囊干细胞是毛发中的原始细胞,其分化经[22]毛囊干细胞、TAC和有丝分裂后分化细胞(postmitotic differentiating cells,PDC) 三个阶段[17]。用克隆形成能力来鉴别毛囊干细胞,大而活跃生长的克隆是干细胞形成的,仅分裂很少次数就进入终末分化的细胞被认为是TAC。细胞的集聚是由于其低运动性,反映了干细胞较TAC更大的细胞间粘附力,是整合素高水平表达的结果。
　　4.4毛囊干细胞标记物：为了对毛囊干细胞进行体外研究，寻找特异的干细胞标记物对干细胞分离培养尤为重要，毛囊干细胞尚无特定的表面标记物。目前已知高表达的分子有K15、K19、整合素、CD200及CD34等[23]，K19一般认为毛囊的隆突部干细胞及胎儿、新生儿表皮基底层干细胞均表达K19, 成人无毛发皮肤如手掌、脚掌部位基底层的干细胞K19表达阳性,但有毛发皮肤基底层中的表皮干细胞K19表达为阴性而毛囊隆突部细胞K19表达为阳性,与LRC位置一致。双重标记研究证实,隆突部中K19阳性细胞是LRC,具有干细胞的慢周期性，但K19是否能标记全部表皮干细胞仍有待进一步研究[24]。毛囊隆突部中K15阳性细胞亦为LRC,并且表达整和素的水平明显高于毛囊外根鞘周围细胞。进一步研究发现,在毛囊干细胞分化过程中,K15表达减少较K19出现更早, 据此推断K15表达量下降可能是细胞向TAC分化的最早征象之一,K15阴性而K19阳性的细胞可能是“早期”TAC,提示K15可能较K19在鉴别毛囊干细胞更有意义[25]。β1整合素表达于表皮基底层和毛囊隆突部。在人类的表皮,β1整合素的高水平表达是毛囊干细胞的标记，但并非所有的β1整合素阳性细胞都是干细胞,TAC也有表达。p63被认为是毛囊干细胞的标志之一。p63是肿瘤抑制因子之一,是p53的同族体,结构和功能与之类似。Pellegrini等[26]发现在角膜缘的基底细胞有p63表达,而在角膜表面的TAC没有p63表达,因而认为p63是表皮干细胞的标志物，但p63在毛发基质中亦有表达。CD34是造血干细胞特异性标记物,最近研究发现其在隆突部高表达[27],在鼠毛囊中检测发现CD34与LRC和K15阳性细胞在毛囊处位置一致。Trempus提出CD34可能是鼠毛囊干细胞最特异的标记物[28]，尽管CD34也在真皮细胞中表达，但CD34是细胞表面蛋白，应用抗CD34抗体标记可通过荧光激活细胞分类法收集活性隆突部细胞，但有研究表明在人毛囊隆突部中发现其表达下降或缺失,而CD200 阳性细胞表现出更高的克隆形成率[29]，在鼠毛囊外根鞘细胞中也有CD200 表达[30]。CD200 是一种I型膜糖蛋白,属于免疫球蛋白超家族,受体表达在巨噬细胞表面及T细胞亚群上[31]。CD200与CD200受体间的相互作用可以传递抑制性信号减低髓样细胞的活性,改变其迁移,在免疫疾病和抑制排斥反应中作为一种免疫耐受信号[32], 提示未来几年对于人毛囊及毛囊干细胞的免疫研究将成为新的热点[33]。单克隆抗体C8/ 144B,最初用于抗T细胞蛋白CD8的羧基末端肽,可选择性地表达于毛囊隆突部的角质形成细胞及淋巴细胞亚群。在C8/144B染色阳性部位,β1整合素、K15和K19均阳性表达，故单克隆抗体C8/144B被认为是识别毛囊干细胞的一个标记物[34]。单克隆抗体H4仅表达于毛囊隆突部，亦被认为是毛囊干细胞的标记物之一。在分离纯化毛囊干细胞前加入以上标记物的相应抗体并染色，分离纯化后应用免疫细胞化学、免疫组织化学、原位杂交、荧光标记识别及同焦点显微镜检测法已成为对毛囊干细胞进行识别鉴定的主要方法。
　　4.5 RT-PCR检测技术的应用[12，35]：抽提分离得到细胞总的mRNA，进行RT-PCR反应，在特定的条件下对毛囊干细胞的标记物如K15、K19等进行逆转录，所得产物电泳条带与Marker 条带位置进行比较,判断细胞内标记物的含量。此方法也可对体外培养干细胞传代情况的判断。
　　对毛囊干细胞的识别目前没有公认的特异的方法，因此需要联合应用以上方法对分离纯化的毛囊干细胞进行识别并对毛囊干细胞体外传代情况进行检测。
　　
　　5问题与展望
　　
　　目前对于毛囊干细胞的研究已取得的了很大进步，但对分离纯化及识别方法的研究仍存在着许多问题：
　　5.1没有规范的分离纯化方法，分离纯化毛囊干细胞的纯度不足：目前分离纯化毛囊干细胞的技术较多，但没有公认的纯度高的分离纯化方法，应用目前常用分离纯化的方法分离毛囊干细胞的纯度大约在50%～90%之间[13]，组织块法分离的毛囊干细胞纯度较低，约在50%左右，应用差速贴壁法纯化毛囊干细胞可获得纯度为90%以上的毛囊干细胞[16]。
　　5.2 分离的毛囊干细胞体外传代培养几代后其增殖能力下降[13]：消化法获得的干细胞经历倍增期后,生长速度减慢,进入平台期。免疫组化染色和克隆形成率结果显示,第3 代、7 代组织块法免疫组化阳性率和克隆形成率明显高于消化法,两种方法之间差异极显著(P 　　[2]George Cotsarelis.Gene expression profiling gets to the root of human hair follicle stem cells[J].Clin Invest,2006,116(1):19-20.
　　[3]Cotsarelis G,Sun TT,Lavker RM.Label-retaining cells reside in the bulge area of pilo sebaceous unit: Implications for follicular stem cells,hair cycle,and sk- in carcinogenesis[J].Cell,1990,61(3):1329.
　　[4]Taylor G,Lehrer MS,Jensen PJ,et al.Involvement of follicular stem cell in forming not only the follicle but also the epidermis[J].Cell,2000,102(4):451-461.
　　[5]Lavker RM,Sun TT.Epidermal stem cells:properties,markers,and location[J].Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(25):13473-13475.
　　[6]Lyle S,Christofidou-Solomidou M,Liu Y,et al.Human hair follicle bulge cells are biochemically distinct and possess an epithelial stem cell phenotype[J].J Invest Dermatol,1999,4(3):296-301.
　　[7]Moll I.Proliferative potential of different keratinocytes of plucked human hair follicle[J].J Invest Dermatol,1995,105(1):14-21.
　　[8]Commo S,Gaillard O,Bernard BA.The human hair follicle contains two distinct K19 positive compartments in the outer root sheath:a unifying hypothesis for stem cell reservoir[J]? Differentiation,2000,66(425):157-164.
　　[9]Potten CS.Booths C1 Keratinocyte stem cells : a commentary[J].J Invest Dermatol Symp Proc,2002,119:888.
　　[10]Fuchs E,Tumbar T,Guasch G,et al.Socializing with their neigbors:stem cells and their niche[J].Cell,2004,116:769-778.
　　[11]Yang JS,Lavker RM,Sun TT.Upper human hair follicle contains a subpopulation of keratinocytes with superior in vitro proliferative potential [J].J Invest Dermatol,1993,101(5):652-659.
　　[12]张群,丛笑倩,张文杰,等.利用中性蛋白酶消化法扩增毛囊干细胞的实验研究[J].上海交通大学学报（医学版）,2007,27(4):387-391.
　　[13]史明艳,杨学义,窦忠英.山羊毛囊干细胞分离培养方法研究[J].畜牧兽医学报,2006,37（5）:436-440.
　　[14]唐建兵,李 勤,陈 璧,等.两种人毛囊外根鞘细胞培养方法的比较[J].广东医学,2005,26（1）：44-45.
　　[15]Jones PH,Watt FM.Separation of human epidermal stem cells for transit amplifying cells on the basis of differences in integrin function and expression[J].Cell,1993,73:713-724.
　　[16]张 群,杨光辉,丛笑倩,等.差速贴壁法分选人毛囊干细胞的研究[J].中华实验外科杂志,2006,23（6）：755-757.
　　[17]Jones PH,Watt FM.Separation of human epidermal stem cells from transit amplifying cells on the basis of differences in integrin function and expression[J].Cell,1993,73(4):713.
　　[18]Zhang Y,Xiang M,Wang Y,et al.Bulge cells of human hair follicles:segregation, cultivation and properties. Colloids Surf B Biointerfaces,2006,47(1):50-56.
　　[19]谭 挺,胡志奇,周洪军.显微分离培养与免疫磁珠法分离纯化人毛囊干细[J].中国修复重建外科杂志,2008,22（2）:202-205.
　　[20]Morris RJ,Fischer SM,Klein Szanto AJ,et al.Subpopulations of primary adult murine epidermal basal cells sedimented on densitygradients[J].Cell Tissue Kinet,1990,23(6):587.
　　[21]Bickenbach JR.Identification and behavior of label-retaining cells in oral mucosa and skin[J].J Dent Res ,1981,60:1611.
　　[22]Tani H,Morris RJ,Kaur P.Enrichment for murine keratinocyte stem cells based on cell surface phenotype[J ].Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(20):10960.
　　[23]李睿书,王石泉.毛囊干细胞[J].细胞生物学杂志,2007,29:457-462.
　　[24]Michel M,L Heureux N,Auger FA,et al.From newborn to adult: pheno typic and functional properties of skin equivalent and human skin as a function of donorage[J].J Cell Physio l,1997,171(2):179-189.
　　[25]Lyle S,Christofidou Solomidou M,Liu Y,et al.The C8/144B monoclonal antibody recognizes cytokeratin 15 and defines the location of human hair follicle stem cells[J].J Cell Sci,1998,111(21):3179-3188.
　　[26]Pellegrini G,Dellambra E,Golisano O,et al.p63 identifies keratinocyte stem cells[J].Proc Natl Acad Sci U SA,2001,98(6):3156.
　　[27]Trempus CS,Morris RJ,Bortner CD,et al.Enrichment forliving murine keratinocytes from the hair follicle bulge with the cell surface marker CD34[J].J Invest Dermatol,2003,120(4):501-511.
　　[28]Carol S,Trempus1,Rebecca J.Morris,CD34 Expression by Hair Follicle Stem Cells Is Required for Skin Tumor Development in Mice[J].Cancer Res,2007,67(9):4173-4181.
　　[29]Ohyama M,Terunuma A,Tock CL,et al.Characterization and isolation of stem cell-enriched human hair follicle bulge cells[J].J Clin Invest,2006,116(1):249-260.
　　[30]Rosenblum MD,Olasz EB,Yancey KB,et al.Expression of CD200 on epithelial cells of the murine hair follicle: a role in tissue-specific immune to lerance[J]? J Invest Dermato,2004,123(5):880-887.
　　[31]Michael D,Rosenblum, Edit B, et al.Truitt Expression of CD200 on Epithelial Cells of the Murine Hair Follicle: A Role in Tissue-Specific Immune Tolerance[J]? J Invest Dermatol,2004,123:880-887.
　　[32]Cotsarelis G.Gene expression profiling gets to the root of human hair follicle stem cells[J].J Clin Invest,2006,116(1):19-22.
　　[33]Stephen Lyle1,Melpo Christofidou-Solomidou,Yaping Liu,et al.The C8/144B monoclonal antibody recognizes cytokeratin 15 and defines the location of human hair follicle stem cells[J].J Cell Sci,1998, 111:3179-3188.
　　[34]杨 恬,向明明.一组毛囊真皮乳头细胞的单克隆抗体[J].解剖学报,2000,31（3）:277-279.
　　[35]Hong Yu,Dong Fang,Suresh M,et al.Isolation of a Novel Population of Multipotent Adult Stem Cells from Human Hair Follicles[J].AJP,2006,168(6):1881.
　　[36]耿松梅,王剑利,王万卷,等.毛囊干细胞定位和体外向表皮分化[J].中国医学科学院学报,2006,28（3）:360-362.
　　
　　[收稿日期]2008-05-22[修回日期]2008-07-28
　　编辑/李阳利