人表皮干细胞改良培养及其组织工程皮肤的构建|干细胞与组织工程

　　[摘要]目的：改良传统人表皮干细胞（hESCs）分离、培养方法，为组织工程皮肤构建提供产率更高、活力更好的种子细胞。方法：应用改良的酶消化法（改良法）及传统酶消化法（传统法）分离、培养hESCs，倒置显微镜观察细胞形态，MTT法绘制生长曲线、免疫组化法测定hESCs标志物角蛋白19（K19）和β1整合素的表达，并且进一步比较上述两种方法所获种子细胞构建的组织工程皮肤的形态学的特性。结果：台盼蓝染色显示改良法细胞消化分离数为92.25±15.61个，传统法细胞消化分离数为68.50 ± 26.91个（P 　　1.2人表皮干细胞分离、培养：修剪皮下结缔组织，0.9% NaCl浸泡、清洗3遍，每次5～10min，0.05%醋酸氯已定+0.9% NaCl（1:2，体积比）浸泡5～8min，再次0.9% NaCl浸泡清洗3遍，每次10min，然后将上述组织块置于4℃ Dispase酶(0.25%)浸泡14～16h。以下为两种方法分离人表皮干细胞。
　　传统方法：取出皮片，0.9% NaCl反复清洗，分离表皮和真皮层，剪碎表皮为1.0mm×1.0mm，加0.25% Trypsin + 0.02% EDTA，37 ℃水浴10min加入含有10% FBS的DEME终止消化。反复吹吸至细胞悬浮，200目筛网过滤，1 000rpm离心5～10min，弃上清，收集细胞，用人表皮干细胞培养基重新悬浮细胞（10ml），吹打成单细胞悬液，台盼蓝染色。并接种于预先铺有Ⅳ型胶原的25cm2培养瓶内，置于37℃，5% CO2孵育箱中孵育10～15 min后，吸出培养液及未贴壁细胞，PBS洗2次，加入适量新鲜培养基（K-SFM，5ng/ml hEGF，30 μg/ml BPE）继续培养。
　　改良方法：取出皮片，0.9%氯化钠反复清洗，分离表皮和真皮层，将表皮置于小抗生素瓶后加0.125% Trypsin+ 0.01% EDTA3ml，弯头吸管快速搅拌2min，吸出并加入离心管（已经加有10% FBS的DMEM 1.5ml）中和，再次重复消化一次，吸出后加入另一离心管（已经加有10% FBS的DMEM 1.5ml）中和，将前后两次消化液体合并，离心（1 000rpm，5min），PBS10ml悬浮细胞，台盼蓝染色鉴定后，再次离心（1000rpm，5min），表皮干细胞培养基（K-SFM）悬浮细胞，接种于预先铺有Ⅳ型胶原的培养瓶内，置于37℃，5% CO2孵育箱中孵育4～5min后，吸出培养液及未贴壁细胞，PBS洗2次,加入适量新鲜表皮细胞培养基培养（K-SFM，5ng/ml hEGF, 30μg/ml BPE）。
　　1.3表皮干细胞增殖：将两种方法分离出的hESCs分别作MTT比色试验。两组细胞均以1×105个/孔的密度接种预先铺有Ⅳ型胶原的24孔板内，每24h取3孔做MTT比色实验。根据每天记录的细胞数绘制细胞生长曲线图。
　　1.4 表皮干细胞鉴定：取二代表皮干细胞培养36 h，PBS清洗3遍，4%多聚甲醛固定30min，PBS清洗；0.1%Triton X-100孵育10min；PBS清洗3次，每次5min；3%H2O2去离子水孵育5～10min，以消除内源性过氧化物酶活性；2%山羊血清封闭20 min,加入CK19（1:50稀释）、整合素-β1（1:50稀释）一抗4 ℃过夜；PBS洗5次，滴加生物素化二抗工作液200μl，37℃孵育10min，PBS洗5次；滴加辣根酶标记链霉素卵白素工作液200μl, 37℃孵育10min，PBS洗5次；显色剂显色。
　　1.5构建组织工程皮肤：以两种不同方法分离、培养的hESCs为种子细胞，鼠尾胶原复合成纤维细胞作为支架材料构建组织工程皮肤。4ml 5×DMEM和14ml胶原于冰上混匀，用1mol/L NaOH调至中性后，加入2mlFBS（含2×106成纤维细胞）混匀，以3ml/孔加入Transwell小室内，放入37℃，5% CO2孵箱培育，待其凝固后加入10% FBS的DMEM，继续培养，24h后将2代hESCs以3×106/孔种植于鼠尾胶原表面，气-液面培养1周。
　　1.6 统计学分析：采用SPSS11.0软件进行统计处理，实验数据以x±s表示，两组间均数比较行两样本t的方差分析， P＜0.05为差异有显著性意义。
　　
　　2结果
　　2.1 改良消化法和传统消化法细胞消化效率的比较：将同一块包皮组织等份分开，用两种方法同时分离表皮细胞，台盼蓝染色、细胞计数（总体积均为10ml），实验独立重复5次。
　　2.2改良法和传统法分离细胞形态学比较：采用Ⅳ型胶原粘附法分选表皮干细胞，改良法较传统法粘附细胞密度大，4h后大部分细胞贴壁良好，镜下可见细胞胞体小，核质比大，呈三角形或多边形。接种后第二天培养基中存在一定数量的漂浮细胞，但改良法漂浮细胞数明显少（图2）。3天后，有部分细胞形成较小克隆，胞体紧密相靠，胞膜互相衔接，呈典型“铺路石样”生长。
　　2.3改良法和传统法细胞增殖比较：两组细胞在第2天细胞数量有所下降，均在第4天时进入对数生长期，改良法细胞在对数期呈明显上升趋势，于第7天到达平台期，镜下观察细胞融合；传统法细胞对数期上升缓慢，第8天时细胞仍未融合。由此表明出改良法细胞活性较好生长较快（图3）。
　　2.4改良法和传统法分离细胞的鉴定天对采用两种方法培养的hESCs行K19、β1整合素免疫染色，结果显示，95%以上细胞K19、β1整合素均呈阳性表达(图4)，且两种方获得的表皮干细胞生物学特性无显著差异。
　　2.5 改良法和传统法分离的细胞构建组织工程皮肤组织学比较：两种方法分离培养的hESCs分别构建出的组织工程皮肤均呈3层：由下到上为真皮层、表皮层、角质层。改良法细胞构建的组织工程皮肤表皮层厚，约5～6层，表皮和真皮交接处可见细胞排列整齐，形似基底细胞。传统法细胞构建的组织工程皮肤表皮层较薄，约3～4层，表皮真皮交接处未见类似基底细胞（图5）。
　　
　　3 讨论
　　hESCs是皮肤组织的特异性干细胞，具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能。是皮肤发生、修复、重塑的关键性源泉[5]，以其作为种子细胞构建组织工程皮肤，可获得与生理皮肤相类似的组织结构。临床上大面积较深度烧伤往往导致表皮、真皮的损伤缺失，近年来，利用含有hESCs的组织工程皮肤覆盖创面取得一定的效果，而在其构建的过程中表皮干细胞的分离培养是必须面对的问题。
　　传统的方法中表皮层与真皮层分离后，用剪刀剪碎成1.0mm×1.0mm大小后进行胰蛋白酶消化，减碎的过程中暴露在组织边缘的细胞增多，而剪刀的挤压可对组织造成挤压损伤[6]，导致部分细胞壁损害进而细胞活力下降或死亡，在改良的方法中，直接进行胰酶消化避免了这一损伤情况的发生。在胰酶消化这一步，传统方法采用0.25%胰蛋白酶＋0.02% EDTA，37℃水浴，10min，而改良方法以0.125%＋0.01% EDTA胰蛋白酶也可以消化下来表皮干细胞，并且胰蛋白酶的含量低，减少了胰蛋白酶对细胞的损伤。当胰酶将细胞分泌的粘蛋白膜水解后，如还没有终止它的活性，此时胰酶就有可能进攻细胞内的某些蛋白质，造成它们的解离，进而诱发细胞凋亡[7]。胰酶浓度的降低也少了中和血清的用量，从而降低了血清对hESCs分化的影响[8]。对比传统方法，将37℃消化改为常温下消化，进一步降低胰酶的活性。为了进一步减少胰酶对细胞的损伤，再将传统方法的消化10min改良为2次消化，每次2min总计4min，每次消化后立即终止。以往的方法中，用来消化时，将剪碎的细胞置于胰酶中反复吹打，而吹打本身也会造成细胞损伤，且吹打容易产生泡沫加剧细胞损害，本改良方法中，只以吸管做搅动，充分均匀胰酶的消化作用又不会产生吹吸的作用，减少了细胞在反复吹打过程中的损伤。
　　将同一块包皮组织等份分开，用两种方法同时分离hESCs，台盼蓝染色结果表明：改良法的活细胞率明显大于传统法细胞，从形态上观察，细胞展开生长无差异。我们用两种方法培养的原代细胞绘制细胞生长曲线（图3），可以看出改良法细胞存活数量多，增殖速度快，细胞活性好，证明了改良法培养可以快速获得大量hESCs。研究表明，K19表达阳性的细胞多分布在毛囊隆突部和基底膜，且具有干细胞的慢周期性和强大的增殖特性，而终末分化的表皮细胞则表达K10。所以K19也被认为是表皮干细胞的特异性标志[9]。β1整合素不仅介导表皮干细胞与细胞外基质的黏附，也调控终末分化启动，β1整合素表达的降低会刺激表皮干细胞离开干细胞池，向上迁移成为终末分化细胞，因而认为β1整合素高表达可以是表皮干细胞的标志物之一[10-11]。我们将应用Ⅳ胶原快速贴壁的改良法细胞通过细胞免疫化学方法研究，显示改良法细胞K19、β1整合素呈阳性表达，证实了采用改良方法培养的细胞为hESCs。进一步分别采用两组细胞为种子细胞，鼠尾胶原为支架构建组织工程皮肤，组织切片HE染色显示改良组hESCs细胞构建的组织工程皮肤表皮层较厚，细胞复层多，表皮细胞复层层数为5～6层、基底细胞排列整齐，而传统组hESCs构建的组织工程皮肤表皮细胞复层层数为3-4层、基底细胞排列散乱，表明应用改良组细胞更适宜构建组织工程皮肤（图5）。
　　表皮干细胞是一种在成年期还能维持较高的自我更新能力的细胞群，在正常状态下维持表皮的自我更新，当受到损伤刺激时，表皮干细胞可以参与皮肤损伤的修复[12]，本研究采用改良法分离培hESCs并与传统方法对比，显示出改良方法培养出的hESCs活力和增值能力更好，构建的组织工程皮肤具有更好的形态结构，为以表皮干细胞为种子细胞构建组织工程皮肤进一步奠定了基础。
　　
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　　[收稿日期]2010-10-16 [修回日期]2010-12-27
　　编辑/张惠娟