细胞分子生物学专业【细胞与分子生物学课程论文】

　  

　细胞与分子生物学课程论文

　学   院        生命科学学院            

　 专   业            植物学               

　     学   号         201***6002             

　   姓   名             常*                

　2014 年 1 月 10日

　细胞死亡方式及其检测方法

　摘要：细胞因受严重损伤而累及胞核时，呈现代谢停止、结构破坏和功能丧失等不可逆性变化，此即细胞死亡。细胞死亡包括坏死和凋亡两大类型。传统的细胞死亡方式分类包括细胞坏死和细胞凋亡2种，后者又称为程序性细胞死亡。死亡的原因很多，一切损伤因子只要作用达到一定强度或持续一定时间，从而使受损组织的代谢完全停止，就会引起细胞、组织的死亡。近期又发现了很多细胞死亡的途径，为了能够对细胞死亡有更透彻的了解，我们可以从其检测方法入手，反向地学习死亡途径和方法，本文总结了最常用的检测方法。

　关键词：细胞死亡，凋亡，坏死，检测方法，DNA片段，

　Abstract：The traditional way of cell death classification includes cell necrosis and apoptosis, the latter also is known as programmed cell death, recently we have discovered a lot of cell death pathways, in order to be have a more thorough understanding, we can start with detection method so that have a good understanding of means of death. this article summarizes the most commonly used detection methods and will get a great help for our learning.

　Key words: cell death, Apoptosis, Necrosis, Detection methods, DNA fragments

　长期以来, 细胞死亡方式分为2种, 即坏死和凋亡, 后者又称程序性细胞死亡( programmed cell death, PCD)。近年来随着研究的深入，为了能对细胞死亡的机制和途径进行更深入的了解, 许多科学家发展了越来越多的检测方法。为了利于对各种检测方法的了解和选择，本文对目前常用、实用及新发展的一些检测细胞死亡方式的方法进行了总结，对各种检测方法的检测原理、判定标准及优缺点进行了描述。

　1.细胞的死亡方式

　1.1坏死

　1.1.1坏死的机制

　坏死一般认为是病理性的原因造成，是一种无规则的细胞死亡方式，通常受到严重和急性的损伤(比如急性的缺氧和突然的营养供给不足等)，严重的物理化学伤害(热、清洗剂、强碱、辐射等) 都会引起细胞的坏死。细胞内的ATP 含量的降低，高浓度的ROS(氧化物)，BCL-2的大量表达引起的BCL家族蛋白表达的失衡, caspases 活性被抑制，都可能会造成细胞的坏死途径[5]。

　1.1.2坏死细胞的形态学特征

　细胞坏死表现为细胞肿胀，细胞膜的快速崩解，细胞器的崩溃。细胞膜的崩解使得细胞内容物溢出，导致细胞周围的炎症反应[6]。细胞核在坏死过程中的主要变化：1）核浓缩(Pyknosis)：即核体积变小，染色质浓缩、深染；2）核碎裂(Karyorhexis)：即核染色质凝集，崩解呈碎粒状聚体在核膜处，随着核膜的破裂， 染色质的颗粒就直接地分散于胞浆中，倘若细胞膜亦破坏，则核碎粒就可分布于细胞外；3）核溶解(Karyolys is )[7]。

　1.2凋亡

　1.2.1凋亡的机制

　细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象，在多细胞生物去除不需要的或异常的细胞中起着必要的作用。它在生物体的进化、内环境的稳定以及多个系统的发育中起着重要的作用。细胞凋亡不仅是一种特殊的细胞死亡类型，而且具有重要的生物学意义及复杂的分子生物学机制。

　细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。凋亡又称程序性的死亡( Programmed cell death , PCD) [1]。凋亡除了发生在正常的细胞外，凋亡的诱发可以病理性的原因引起或由环境刺激引起，例如，D N A损伤、氧化压力、激素、病毒、毒素、药物、营养不良等，当然凋亡既可由病理性的原因引起，也可以是正常的细胞死亡网[2]。形成的凋亡小体最后被附近的细胞吞噬， 因而避免了体内炎症的产生[3]。

　凋亡是多基因严格控制的过程。这些基因在种属之间非常保守，如Bcl-2家族、caspase家族、癌基因如C-myc、抑癌基因P53等，随着分子生物学技术的发展对多种细胞凋亡的过程有了相当的认识，但是迄今为止凋亡过程确切机制尚不完全清楚。而凋亡过程的紊乱可能与许多疾病的发生有直接或间接的关系。如肿瘤、自身免疫性疾病等，能够诱发细胞凋亡的因素很多，如射线、药物等。

　细胞凋亡主要有两种途径：一种是外源性的(即经细胞死亡因子受体介导的细胞凋亡)，另一种是内源性的(即经线粒体途径)。虽然经过两种不同的途径，但最终都必须经过一种为caspases的家族成员介导的蛋白酶级联反应过程，作用于底物而导致凋亡[4]。也有报道在组织缺氧和酸毒症作用于心肌细胞时，细胞凋亡并不激活caspases。

　1.2.2凋亡细胞的形态特征

　凋亡的细胞皱缩，细胞间的连接消失，同时细胞间的密度增加，核质浓缩成一个或几个大的包团，染色质迁移至核模周边形成新月形凝集，进而细胞核裂解为碎块，进而细胞膜内陷自行分割成几个由细胞膜包裹的，表面光滑的凋亡小体( Apoptotic bod

　y)；DNA 被特异性的核酸内切酶分解成18 0 ~ 220bp的片断，琼脂糖电泳出现特征性DNA梯状区带，在细胞凋亡早期需要大量的ATP。

　1.3凋亡和坏死的区别

　为了更加彻底明白两种死亡方式的不同，可以从两种的不同特征做个比较。如表一

　表一：细胞凋亡和细胞坏死的区别

　特征

　细胞凋亡

　细胞坏死

　诱发因素

　特定的或生理性

　各种病理性

　细胞数量

　单个细胞丢失

　成群细胞死亡

　质膜

　完整保持

　肿胀溶解破裂

　细胞核

　固缩破裂为片段

　溶解破裂

　染色质

　凝集呈半月状

　模糊疏松

　线粒体

　肿胀通透性增加，细胞C释放

　肿胀破裂

　细胞器

　完整

　损伤

　内含物释放

　无

　有

　炎症反应

　无

　有

　核DNA

　降解为完整倍数大小的片段

　随机不规则断裂

　凝胶电泳

　梯状条带形

　分散形态

　2. 细胞死亡检测方式

　细胞死亡的方式可根据形态学、细胞膜通透性及染色体变化情况，并可结合各种染色或标记方法来确定。最常用的观察方法是用光镜、电镜或共聚焦荧光显微镜观察细胞、细胞核形态、细胞膜及细胞超微结构的改变，并按目前大多数学者接受的形态学标准加以鉴别。

　2.1线粒体跨膜电位检测法

　线粒体膜电位是由线粒体内膜两侧质子的不对称分布而形成的电化学梯度， 在细胞凋亡过程中常因膜孔道大小的改变及转膜电位的降低来调节细胞凋亡。在凋亡早期，当线粒体形态学方面尚无明显变化时，其膜电位已经发生耗散。因此， 其膜电位的耗散被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，而且一旦线粒体膜电位耗散，凋亡就不可逆转。但使用该方法时要始终保持平衡染液pH值的一致性。线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料如JC-1等可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。但是要注意的是，除了在凋亡中出现线粒体去极化外，在胀亡中也可发生此现象。[8]

　2.2 DNA片段检测

　细胞发生凋亡或坏死时，DNA发生断裂，胞质内出现DNA片段。探测DNA 片段可用琼脂糖凝胶电泳、酶联免疫吸附法、TUNEL法及其它检测方法如ISEL( insitu end labeling)、ISOL( Insituo ligo Ligation)。

　2.2.1TUNEL法

　 TUNEL方法是通过检测DNA 双链断裂暴露出的粘性3c-OH 末端来确定凋亡的经典方法。在脱氧核糖核苷酸末端转移酶的作用下，DNA的3c-末端与荧光素、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素标记的脱氧核糖核苷酸结合，从而进行凋亡细胞检测。TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离出来的细胞，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。用光学显微镜或共聚焦显微镜观察TUNEL检测结果，阳性着色的为凋亡细胞[11]。TUNEL法标记的是凋亡晚期阶段的细胞，在此阶段,细胞形态已经明显紊乱。虽然TUNEL 方法能识别发生凋亡的细胞，但是有时凋亡和坏死重叠，因此一些凋亡性细胞未染色。这使得在一些情况下会低估凋亡信息。而且，甲醛固定能妨碍TUNEL染色，被标记的细胞和周围正常细胞的对照性较差。在组织切片上难以确定准确结果。TUNEL染色对凋亡来说不是特异的，在胀亡中也可以见到[12]。

　2.2.2琼脂糖凝胶电泳和酶联免疫吸附法

　 凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180~200 bp DNA片段，而胀亡或坏死细胞DNA 断裂点为无特征的弥漫性随机片段，利用这些特征使用琼脂糖凝胶电泳可以确定细胞的死亡方式。凋亡细胞经电泳后出现阶梯状(DNA Ladder) 条带；而胀亡或坏死细胞经电泳后呈随机性电泳条带[9]。观察DNA最常用的方法是利用荧光染料EB进行染色。凝胶应该在无EB情况下电泳, 电泳结束后用EB染色。但是要注意的是，在坏死中发生的蛋白水解途径也能导致将DNA分裂为核小体间片段的酶激活，因此也可能出现DNA 阶梯状条带，这与凋亡过程中见到的情况不能区别[10]。

　凋亡细胞的DNA 断裂使细胞质内出现核小体，核小体由组蛋白及DNA片段组成，可用酶联免疫吸附法检测。

　2.3组化染料

　根据染料与细胞组分结合的不同分为细胞核染料、细胞膜染料和细胞质染料。死亡的细胞和活的细胞与染料的亲和性不同，在电镜下观察可以分辨出细胞的存活情况。

　2.3.1细胞核染料

　常用的细胞核染料有Hoechst、PI、DAPI、AO(acrid ine orange)和EB等方法。

　2.3.1.1 Hoechst是一种不需要透化作用就可以穿透细胞膜并将DNA 染色的的蓝色荧光染料[16]，是与DNA 特异结合的非细胞毒性活性染料，优先与双螺旋小沟外面的三个腺嘌呤和胸腺嘧啶碱基对结合[17]，既可染有活力的细胞又可染发生凋亡的细胞，常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜(在紫外光照明下)观察或流式细胞仪检测。细胞发生凋亡时，会看到凋亡细胞的细胞核呈致密浓染或呈碎块状致密浓染，凋亡细胞的凝缩染色质着色比正常细胞的染色质更亮。

　2.3.1.2

　 PI是一种核酸荧光染料，用作死亡或正在死亡细胞的一种标志物，因为此染料不能穿透活细胞的质膜，而只穿过受损细胞膜进入细胞[18]，所以在凋亡晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。PI染阳性、细胞核不凝聚或断裂的细胞认为是坏死性的[19]。

　2.3.1.3 DAPI( 4c,6-d iam id ino-2-pheny lindo le) DAPI也是一种标记细胞核的蓝色荧光染料，能够与DNA中大部分A、T碱基相互结合，因为DAPI可以透过完整的细胞膜，它可以用于活细胞和固定细胞的染色。DAPI染色常用于细胞凋亡检测。染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。在荧光显微镜下观察时，利用紫外光激发，显示染色体浓缩、核分成小裂片或断裂。

　2.3.1.4 AO为一种膜通透性活体染料，可区别正常和凋亡细胞核，在活细胞中，AO 可作为一种PH 指示剂，因为它被酸性层包围时会发出鲜亮的黄或橘红色光。正常和凋亡性细胞核染色不同，正常PH 时, AO将双链核酸染为绿色，在凋亡过程中因为细胞核酸化、PH 值降低而将凋亡细胞核染为黄或橘红色。因此，AO已被用作识别凋亡细胞的染色方法，这种简单的方法可灵活地附加到其它方法以识别和研究凋亡性细胞。如依次使用AO和EB染色，使用共聚焦显微镜观察。EB不能穿透活细胞的质膜，而只穿过受损的细胞膜进入细胞[18]，选择性地标记细胞膜受损的细胞，AO具有细胞渗透性，活和死亡细胞均标记。两种染色方法的结果是：活细胞核AO染色呈绿色，凋亡细胞核AO染色呈黄或橘红色；坏死细胞核进一步EB染色呈红色，显示为绿色和红色光谱区共存。

　2.3.2细胞膜染料(Annex in-V)

　在正常细胞, PS 主要位于质膜的内小叶，而在凋亡早期，PS从质膜的内小叶易位到外小叶(发生在核断裂之前)，这可用Annex in-V来识别。Annex in-V是一种Ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白，对PS高度亲和。将Annexin-V进行荧光素或生物素标记，作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。Annex in-V结合到细胞膜可使我们识别正在凋亡的细胞。Annex in-V与凋亡细胞相结合可在各种活体模型中定量凋亡细胞的数目。Annex in-V 标记为阳性的时程依赖于所测系统的敏感性[20]。Annex in-V法的优点是细胞不需要固定，避免了PI法中因固定造成的细胞碎片过多及TUNEL法中因固定造成的DNA 片段丢失，不仅省时，结果亦更为可靠。然而，此方法不适合阐明关于凋亡动力学方面的问题。

　2.3.3细胞质染料

　2.3.3.1Calcein-AM

　Calcein-AM 是一种非荧光、膜通透性的脂酶底物，后者被动地被装载进细胞。当分子的乙酰氧甲基酯部分水解时释放Calce in，后者不能透过膜, 它被包围在膜完整的细胞胞质内。Calcein在蓝光( 497 nm ) 激发下发出绿色荧光( 517 nm )。Calcein的绿色荧光提示细胞有完整的膜及脂酶活性,

　 使其成为追踪活细胞的有用工具[21]

　2.3.3.2TB( trypan blue)

　 TB用于检测细胞膜的完整性。如果细胞膜不完整、破裂，TB 染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为TB蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。

　2.3.3.3H & E( hem atoxy lin & eosin)、尼氏或银染方法

　 尼氏或H& E染色方法简单，是通过形态学变化或染色强度的变化来推断细胞变性，能显示变性细胞的一些变化，如细胞皱缩，空泡形成和染色过深。银染方法是选择性地将变性细胞染成黑色，而正常细胞不被染，因此，对比度高，容易区分变性和正常细胞。

　2.4流式细胞仪分析( flow cytometry assay,FCA)

　目前在基础研究中，凋亡的定量分析主要依靠流式细胞术。细胞凋亡的FCA 定量分析主要有单参数、双参数、多参数分析及检测断裂点的T UNEL 法等几种方法。FCA 的单参数分析是以荧光探针PI、吖啶橙等特异性染料标记细胞的DNA、RNA、蛋白质等, 通过观察细胞内某种单个成分含量的变化, 来区分凋亡细胞。应用两种荧光染料标记细胞的成分称为双参数分析，如吖啶橙-溴化乙锭染色的淋巴细胞双参数FCA 法，可对DNA/ RNA 、RNA/ 单链DNA、RNA/ 蛋白质等成分组合进行测定。此外, 应用不同谱线的激光光源可以激发两种或多种荧光探针标记的细胞成分，从而可进行多参数分析和定量检测。

　2.5 caspases检测

　caspases是四聚体蛋白酶，在构成上表达为caspases前体。当暴露于凋亡刺激物时，caspases裂解、激活，这反过来导致下游效应器caspases的裂解和激活， 后者启动了导致凋亡过程所具有的形态学改变。其中，caspase-3是诱导细胞死亡过程中的一个关键因素[13]。caspase-3的激活提示PCD进程中注定不可逆地出现细胞死亡[14]。caspase-3的激活是一种代表凋亡的标志。用caspase-3的激活作为凋亡标志的优势是可在死亡过程的早期阶段探测到凋亡细胞[15]。caspase-3激活是一个早期事件，出现于仍有活力的细胞，发生在细胞形态和核结构发生改变之前。对caspases检测可用免疫组化方法，也可用Western Blot分析方法。

　综上所述, 每种凋亡检测方法各具特点，但均有一定的局限性，因此在凋亡检测中应避免使用单一方法, 需结合灵敏性、特异性都较高的多种检测手段, 检测细胞在凋亡发生过程中的不同事件, 可更加准确、客观、全面地反映实验结果。同时对我们进一步研究细胞死亡机制有很大的帮助。

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