间充质干细胞的来源【ERK信号传导通路在人脐带间充质干细胞向成骨细胞分化作用中的研究进展】

　　颌面部各种原因导致的不同程度的骨缺损是困扰着整形、正畸以及颌面外科等口腔临床学科的一大难题。骨组织工程技术被认为是最理想的修复骨缺损的生物学方法[1],其中种子细胞的相关研究最为关键。人脐带间充质干细胞可作为种子细胞分化为成骨细胞,不仅在骨组织工程领域具有广阔的应用前景,同时对人脐带间充质干细胞进行深入的研究进一步了解胚胎细胞发育的特性,从而对儿科尤其是颌面儿科,特别是针对先天性唇腭裂患儿骨组织修复有着积极的意义。在间充质干细胞成骨分化过程中,MAPK信号通路是决定性通路之一,其中ERK通路是MAPK家族中与细胞增殖和起始分化密切相关者。本文将回顾近年来关于ERK信号转导途径在人类脐带间充质干细胞向成骨细胞增殖分化作用的研究,并将这一领域的研究进展综述如下:
　　
　　1 ERK信号传导通路
　　1.1 MAPK通路:丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase,MAPK)属于丝/苏氨酸蛋白激酶,存在于大多数生物体细胞胞质内,参与调节细胞的各种生理功能和变化[1]。早在1989年～1991年,学者们就发现了第一组MAP激酶序列,从而发现了一组新的蛋白激酶[2]。MAPK通过有三至五个环节构成的保守三级酶促级联反应(即MAPKKK-MAPKK-MAPK),激活转录因子,促使核内事件的发生。MAPK是通过VIII区域苏氨酸、酪氨酸双位点磷酸化活化和由脯氨酸介导的Ser/Thr蛋白激酶(其同工酶均有最小共同靶序列Ser/Thr-Pro)[3]。目前,MAPK家族有五大类成员,分别为细胞外信号调节激酶(Extracellular-signal regulated protein kinase, ERK)1/2、c-Jun氨基末端激酶(JNK)/应激激活蛋白激酶(Stress-activated protein kinase, SAPK)、p38MAPK、ERK5/BMK1 (bigMAP kinase 1)和ERK3/4 等[4]。本文就与成骨细胞的发生关系密切的ERK信号转导通路来进行阐述。
　　1.2 ERK转导通路的主要过程:当细胞外基质与前体细胞(如间充质干细胞)接触,细胞外基质即与表面整合素受体结合,受体异源二聚化,自身磷酸化,粘附斑激酶磷酸化,鸟核苷酸交换因子募集,从而使与Ras结合的GDP脱落而结合GTP,激活Ras,然后通过MAPKKK(MEK)-MAPKK-MAPK途径激活转录因子,促进细胞增殖和分化[5]。ERK信号通路是目前研究较为彻底的MAPK通路之一,是多数生长因子、细胞因子调控细胞增殖分化的重要途径,对其机制的深入研究有利于体外诱导间充质干细胞向成骨细胞的分化,从而有助于骨组织工程学的发展。然而近年来,对骨髓间充质干细胞分化的研究较为普遍,尤其是研究其向神经细胞、肝细胞、脂肪细胞以及成骨细胞的分化等,但对于人脐带间充质干细胞的研究报道则相对较少,研究相对滞后。
　　1.3ERK通路与P38、JNK通路之间的关系:真菌中的MAPK信号通路并无相互作用,其每一条MAPK通路都是相对独立的,一般不会发生交联。但是,在哺乳类细胞中各个MAPK信号通路之间通过复杂的机制既可相互区别,又可相互调节,保持其自身的独立性,同时又相互促进或抑制。ERK、JNK、p38MAPK三条通路,总是可以在不同的作用位点找到相互交汇的地方[6]。Hotokezaka等[7]发现p38抑制剂引起p38磷酸化减少的同时伴随了ERK磷酸化的增加,而MEK抑制剂减少ERK的磷酸化同样也使p38的磷酸化程度增加。Suzuki 等[8] 利用鼠颅骨源的成骨细胞系MC3T 32E1 细胞研究发现, 经过胎牛血清诱导,ERK通路可快速激活, 而p38通路 和JNK通路激活则大大延迟。国内廖清船等[9]实验发现植物雌激素金雀异黄酮可激活p38MAPK通路,但同时抑制ERK通路,而人雌激素则对ERK和p38MAPK通路均有激活作用[10]。关于ERK、p38、JNK三者之间究竟是怎样互相作用与调节,具体作用环节在何处,如何形成交联网络等还有待进一步的阐明。
　　2 ERK信号转导通路与人脐带间充质干细胞
　　2.1人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUCMSCs):人脐带间充质干细胞是存在于脐带和血管周围组织中的一种干细胞,具有多向分化和自我更新的潜能[11]。自1966年Friedenstein [12]发现骨髓间充质干细胞以来,由于易于培养、扩增和遗传因素相对稳定的特点而常用于科研中。但骨髓间充质干细胞在具有细胞增殖分化能力的同时,其数目随年龄增长而下降,采集尚不方便,因此临床上也需寻找一种新的间充质干细胞以克服上述不足。人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)就是一类具有自我更新、增殖和多向分化潜能的干细胞,具有来源丰富,易于采集、保存和运输,无异体排斥,避免伦理争议等诸多优点,近年来的研究也表明hUCMSCs有可能替代骨髓间充质干细胞成为重要的种子细胞来源,并有望大量应用于口腔颌面部骨缺损的临床治疗中。
　　2006年,Hoynowski等[13]发现hUCMSCs除了可以表达骨髓间充质干细胞的细胞因子外,还可表达GM-CSF和GSF,并特异性表达HLA-G和神经胶质来源的神经营养因子。Campard等[14]在2008年利用肝细胞生长因子成功地在体外将hUCMSCs向肝细胞分化。2009年,野向阳等[15]对人脐带间充质干细胞进行成骨诱导,其碱性磷酸酶检测阳性,说明其具有骨髓间充质干细胞的特异性表明标志,且具有同种异体移植的低免疫原性。此后还有学者[16]也将人脐带间充质干细胞进行体外诱导培养,并证实hUCMSCs具有成脂、成骨的分化能力。以上研究均表明hUCMSCs可代替骨髓间充质干细胞作为组织工程,尤其是骨组织工程的种子来源。而ERK信号转导通路是间充质干细胞成骨分化的决定性通路之一,故可通过研究ERK调节成骨分化的具体分子机制而促进hUCMSCs向成骨细胞分化,在骨组织工程应用领域有着重要的意义。
　　2.2 ERK信号传导通路在间充质干细胞增殖分化中所起的作用:研究发现,ERK途径对细胞的增殖和诱导起重要作用。廖清船等[17]诱导小鼠的MSCs向成骨细胞分化,观察p44/p42 MAPK通路(即ERK通路)在MSCs向成骨细胞分化过程的作用,实验结果表明p44/p42 MAPK可能参与MSCs的增殖调节。Jalswad等[18]发现,在诱导成人MSCs向成骨细胞分化过程中,ERK具有重要作用。Salasznyk等[19]证明了ERK对ECM诱导的MSCs的成骨分化具有十分重要的驱动作用。2006年,Salasznyk等[20]研究发现胞外基质(ECM),特别是层粘连蛋白(Ln-5)通过ERK相关的信号通路对MSCs的成骨分化起着有效的诱导作用。
　　
　　3ERK信号转导通路与成骨细胞分化
　　3.1成骨细胞:成骨细胞是骨形成的主要功能细胞,负责骨基质的合成、分泌和矿化。骨不断地进行着重建,骨重建过程包括破骨细胞贴附在旧骨区域,分泌酸性物质溶解矿物质,分泌蛋白酶消化骨基质,形成骨吸收陷窝;其后,成骨细胞移行至被吸收部位,分泌骨基质,骨基质矿化而形成新骨。破骨与成骨过程的平衡是维持正常骨量的关键,成骨细胞数目减少、功能减弱将导致骨形成降低,进一步引起骨质疏松。在膜内成骨和软骨内成骨中,MSCs分化为成骨细胞,同时分泌胞外基质,随着细胞外基质的钙化,成骨细胞被包埋在骨质中成为骨细胞。
　　3.2 ERK信号转导通路在向成骨细胞分化过程中的作用:在成骨方面,ERK信号通路起着一个传递细胞内外信号导线的作用,对细胞外各种信号刺激如激素/生长因子的刺激、细胞外基质-整合蛋白的结合及机械负荷的刺激等作出反应。活化的ERK可以磷酸化ELK-1,启动即刻早期基因的表达,在成骨细胞分化过程可以激活众多靶蛋白,包括转录因子复合物AP1和成骨细胞特异性转录因子Osf2 /Cb-fal。Lai等[6]应用显性失活法将ERK-DN ( ERK-dominant negative) 转染人成骨细胞,阻滞ERK/MAPK通路的活性,导致成骨细胞的增殖分化能力下降,阐述了在成骨细胞中ERK不仅对成骨细胞的增殖,而且对成骨细胞的粘附、伸展、迁移以及整合素的表达都有重要意义。此后国内有关学者[21]用不同剂量的ERK通道阻滞剂-PD98059可抑制骨髓间充质干细胞向成骨分化,并存在剂量依赖性,说明ERK通路可能在MSC向成骨细胞分化中起到重要作用。Takami等[22]通过研究说明ERK信号通路对成骨细胞RANKL的表达起重要作用,单独抑制ERK信号通路不能完全抑制RANKL的表达,这与其受多种信号通路调节相关。之后还有学者发现较大的应力改变可以早期激活成骨细胞内的ERK通路[23]。Ge等[24]用转基因技术确定了ERK-MAPK途径通过调节cb-falmRNA的表达而刺激成骨细胞的分化及骨骼发育的作用。2009年,国内研究人员[25]通过实验说明了降钙素刺激phos-ERK1/2蛋白的表达,且上调成骨细胞cb-fa1mRNA的表达。因此,可知ERK参与了对Osf2/Cb-fal的转录调节并且在成骨细胞特异基因表达中发挥重要作用。但是,目前ERK通路对间充质干细胞向成骨细胞的分化作用尚有争议,具体分子机制尚不完全清楚。
　　
　　4前景
　　人脐带间充质干细胞具有自我更新、增殖和多向分化潜能、来源丰富,易于采集、保存和运输,无异体排斥,避免伦理争议等诸多优点,在体内外均可定向分化为骨细胞、软骨细胞、肝细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞以及神经元细胞等,是一种具有多种转化功能的干细胞。hUCMSCs有可能替代骨髓间充质干细胞成为重要的种子细胞来源从而促进骨组织工程的科学研究,并有望大量应用于口腔颌面部骨缺损的临床治疗中,特别是针对面部骨损伤严重的患者和先天骨性畸形的患儿有着重要的临床意义。在这一转化过程中,ERK信号转导通路正是人脐带间充质干细胞hUCMSCs向成骨细胞分化的重要路径之一,对ERK通路的研究不仅可以促进骨组织工程的科学研究,应用于临床实践,同时对ERK通路的研究还可以进一步掌握胚胎细胞发育的特性,从而对儿科尤其是颌面儿科的发展产生积极的意义。
　　虽然人脐带间充质干细胞目前最有可能替代骨髓间充质干细胞成为较为理想的种子细胞,但针对这一类细胞深入的研究尚有不足;另一方面,目前虽有大量针对ERK信号传导通路的实验研究,但这些研究均以小鼠间充质干细胞或人骨髓干细胞为样本,且实验结论尤其是对于临床工作的意义还存在一定争议。但必须指出的是,相比骨髓间充质干细胞而言,人脐带间充质干细胞作为骨组织工程重要的种子细胞,其研究还相对滞后,且细胞信号通路方面的研究较少,尤其是在对骨组织工程至关重要的种子细胞向成骨细胞多向分化的通路途径方面存在争议,所以,对ERK信号转导通路在人脐带间充质干细胞向成骨细胞的分化作用仍有一定的研究空间。相信在不久的将来,通过对人脐带间充质干细胞向成骨细胞分化作用研究的进一步深入,有望使人脐带间充质干细胞应用于骨组织工程的希望成为可能,为面部严重骨性损伤的患者和先天发育畸形的患儿带来福音。
　　
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　　[收稿日期]2010-08-07 [修回日期]2010-10-13
　　编辑/李阳利