正畸力作用下炎性牙周组织中白介素-8的表达_正畸治疗中最常见的牙周组织损伤是

　　[摘要]目的：探讨白介素-8(IL-8)在炎性牙周组织条件下参与牙移动表达的变化规律及牙周组织改建的机制。方法：选用35只雄性SD大鼠，空白对照组5只，其余30只大鼠建立实验性牙周炎模型4周后，去除牙周刺激物后再随机分为6组，分别为炎症对照组，炎症加力1、3、5、7、14天组，每组5只。炎症加力组大鼠上颌一侧第一磨牙与上颌切牙之间安置正畸装置，并施加0.49N近中向正畸力移动第一磨牙。在加力后0、1、3、5、7、14天取材，进行组织形态分析法、免疫组化染色检测IL-8在牙周组织中表达的阳性细胞的面密度值(area density,AD)。结果：空白对照组牙周组织内IL-8表达呈弱阳性，炎症对照组牙周组织内IL-8的表达增强。在牙周受压后，炎症加力1、3、5、7天时，第一磨牙近中压力侧牙周膜组织内IL-8的表达与牙周炎大鼠对照组比较，表达强度高，差异有统计学意义，并且IL-8表达的面密度值在5天时达到峰值，14天时IL-8在牙周组织内的表达继续下降，但强度高于正常对照组。结论：IL-8参与了牙周组织的改建，其表达随时间呈一定的规律；在炎症及正畸力联合效应下，牙周组织的炎症反应程度加重，但不会导致牙周组织的严重破坏。
　　[关键词]正畸力；牙周炎；白介素-8（IL-8）
　　[中图分类号]R783 [文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2011）07-1134-04
　　
　　Effect of orthodontic force on interleukin-8 expression in the inflammatory periodontal tissues
　　MI Cong-bo,PAN Xu,QIAN Ya-jing,HU Ming-hua,LIU Hong,NIE Jing
　　(Department of Orthodontics,The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University,Urumqi 830054, Xinjiang,China)
　　
　　Abstract:ObjectiveTo investigate interleukin-8(IL-8) under the condition of participation in the inflammatory periodontal condition expression changes of tooth movement and periodontal tissue remodeling mechanism.MethodsSelected 35 male SD rats,control group 5,and remaining 30 rats with experimental periodontitis model established after 4 weeks after removal of periodontal stimuli were randomly divided into 6 groups,respectively the control group were inflammation,inflammation afterburner 1,3,5,7,14d group, n=5.Afterburner rats maxillary first molar and the maxillary incisors on one side between the placement of orthodontic divices,and applied to the orthodontic force 0.49N past.1,3,5,7,14d after the afterburner derived,organized morphological analysis,immunohistochemistry detected IL-8 expression in periodontal tissues in the face of positive cell density(area density,AD).Results The periodontal tissue expression of IL-8 in control group was weakly positive, and the periodontal tissue inflammation control expression of IL-8.Compression of the periodontal inflammation afterburner 1,3,5,7d,the first molar in the pressure side of periodontal tissue expression of IL-8 in the control group with periodontitis in rats,the expression of strength,the difference statistically significant, and the expression of IL-8 in the 5d density reached the peak value.When the IL-8 expression in periodontal tissues continued to decline at 14d,but the strength is higher than the normal control group. Conclusion IL-8 participate in the periodontal tissue remodeling, and the expression was a certain time rule.The degree of periodontal tissue inflammation increased by inflammation irritation and orthodontic force,but it does not cause serious damage to the periodontal tissue.
　　Key words:orthodontic force;periodontitis;interleukin-8(IL-8)
　　
　　近年来，随着口腔医学的发展和人们生活条件的提高，人们对口腔健康与牙齿美观的要求也越来越高，临床医师及正畸患者对正畸治疗中牙周组织健康的关注也逐渐增多。白介素-8(Interleukin-8,IL-8)作为一种重要的细胞因子，在炎症反应中趋化和活化中性多形核白细胞(polymorphonuclear leukocyte,PMN)，促进炎症介质的释放，加重局部炎症反应，其在牙周组织中的浓度和量的改变是反映牙周炎症状态的重要参数[1]，在正畸牙移动过程中对牙周组织改建的作用也逐渐被重视[2]。学者们已从正畸牙移动和牙周炎防治领域分别探讨了IL-8在牙周组织中表达的意义[2-3]，而炎性刺激和机械力联合效应下如何变化尚不清楚。本实验通过观察IL-8在正畸力作用下大鼠炎性牙周组织中表达的变化规律，探讨机械力与炎性刺激物对牙周组织改建的联合影响作用，以期有助于正畸基础研究和指导口腔正畸的临床工作。
　　
　　1材料和方法
　　1.1 主要试剂和仪器：兔抗鼠IL-8多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)，SP-9001免疫组化检测试剂盒、DAB显色试剂盒、0.01M PBS缓冲液（PH7.2～7.4）(北京中杉金桥生物技术有限公司)，胰蛋白酶(Sigma公司，美国)，4%多聚甲醛、0.5mol/L EDTA；0.012"正畸用Ni-Ti拉簧(北京有色金属公司)、0.20mm结扎丝(杭州新亚齿科有限公司)，正畸用弹簧测力计、牙科慢速涡轮机、细金刚砂车针，石蜡切片机(LEICARM 2135切片机，德国)，光学显微镜(Olympus，日本），电子天平、超纯水仪(Startorius公司，德国)，Motic BA400自动显微镜(上海精密仪器厂），Motic图像分析系统软件3.2版、Motic Med6.0数码医学图像分析系统(麦克奥迪实业有限公司)。
　　1.2 实验动物及分组：SPF级健康雄性10周龄SD大鼠35只，体重（200±20）g，由新疆医科大学实验动物中心提供，合格号:SCXK(新)2003-0001，由新疆医科大学第一附属医院实验动物中心(该中心经AAALAC International认证，编号为001279)提供实验动物平台。5只作为空白对照组，其余30只建立实验性牙周炎模型4周后，去除牙周刺激物后随机分为6组，分别为牙周炎对照组，炎症加力1、3、5、7、14天组，每组5只，分笼饲养，自由摄食，适应性喂养1周后开始实验。
　　1.3 牙周炎大鼠正畸牙移动模型的建立：加力大鼠腹腔内注射(盐酸氯胺酮100mg/kg、安定5mg、阿托品0.5mg混合稀释至10mL，以0.75mL/100g的剂量)麻醉大鼠，并固定于鼠板上。用安装尖头金刚砂车针的牙科慢速手机，在上颌中切牙唇舌、远中面及第一磨牙近中轴角的颈缘处各制备一深约0.5mm的浅沟，用0.25mm正畸结扎丝在上颌切牙和第一磨牙之间结扎镍钛拉簧(长6mm、直径0.3mm)力值约为0.49N，以上颌中切牙为支抗，拉第一恒磨牙向近中移动。每天查看加力装置，发现脱落立即重新安装。牙周炎对照组大鼠不作处理（如图1～2）。
　　1.4 标本制备：分别在预定时间点以4%多聚甲醛经心内灌注处死各组大鼠，处置方式符合动物伦理学标准。取实验侧3颗磨牙及周围牙周组织，4%多聚甲醛继续固定24h后，置于0.5mol/L的EDTA脱钙6周，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，沿上颌骨矢状向切片，片厚5μm，裱于APES片上，分别进行苏木精-伊红染色及免疫组织化学染色。
　　1.5苏木精-伊红染色：二甲苯脱蜡10min，2次；梯度乙醇脱水各3min，蒸馏水冲洗3min。苏木精染色10min，蒸馏水冲洗3min，盐酸乙醇分色，蒸馏水冲洗。1/400氨水返蓝10s，伊红染色5min，脱水、透明，封固。采用Motic BA400自动显微镜，由不知实验设计及分组情况的同一病理医师读片，观察标本中第一恒磨牙牙周组织后描述结果，并进行图像的采集。
　　IL-8免疫组织化学染色：石蜡切片常规脱蜡至水，体积分数3%过氧化氢闭光浸泡20min，蒸馏水冲洗3次，37℃胰消化法修复抗原20min，蒸馏水冲洗3次，PBS溶液冲洗2次。加入兔抗大鼠IL-8多克隆抗体(1:100)，4℃冰箱过夜，PBS溶液洗2次，滴加生物素化二抗，37℃30min，PBS溶液冲洗2次。DAB显色，苏木精复染，脱水、透明，封固。
　　1.6 结果判定：经免疫组化染色后，采用Motic BA400自动显微镜，由不知实验设计及分组情况的同一病理医师读片。染色结果判定标准：IL-8阳性染色为棕褐色颗粒，定位于细胞质。在低倍镜下观察各组实验侧第一磨牙近中根压力侧根中1/3区域牙周膜内IL-8的表达情况，选择表达较集中的5个视野，换高倍镜采用Motic Image Advanced分析软件3.2版计算IL-8在牙周组织中表达的阳性细胞的面密度值，取均值。将各实验组结果分别与PBS代替一抗的空白对照进行对比观察后，进行图像的采集。
　　1.7 统计学分析：对所测数据采用SPSS17.0软件包，采用独立样本t检验进行统计分析，计量资料以x±s表示，P＜0.05具有统计学差异。
　　
　　2结果
　　2.1 牙周炎大鼠上颌第一磨牙牙周膜组织内IL-8的表达：健康大鼠牙周中，IL-8仅在牙周膜成纤维细胞胞浆中中少量弱表达，第一磨牙近中根压力侧IL-8表达的阳性细胞面密度值为7.96±1.32。牙周炎大鼠牙龈结合上皮及沟内上皮变性糜烂，出现破骨细胞，牙周组织中IL-8表达明显增强，阳性染色范围广泛，牙周膜成纤维细胞、破骨细胞表达呈阳性，第一磨牙近中根压力侧IL-8表达的阳性细胞面密度值为15.57±1.15。牙周炎对照组与空白对照组比较，表达强度高，差异有统计学意义，P＜0.05(如图3～4，见表1)。
　　2.2牙周炎大鼠正畸力作用下牙周组织中IL-8的变化规律：牙周炎大鼠正畸力作用下牙周组织中IL-8的变化规律见表1。由表1可见，牙周炎加力组：加力后IL-8阳性表达增强。加力1天后，压力侧牙槽骨出现透明样变区及骨吸收陷窝；牙周膜成纤维细胞内IL-8免疫组化染色阳性反应逐渐增强。3天组压力侧牙槽骨骨吸收陷窝增多，破骨细胞增多；牙周膜成纤维细胞IL-8表达呈阳性且明显增强。5天组压力侧牙槽骨破骨细胞活跃；IL-8在牙周组织内的表达也达到峰值，在牙周膜成纤维细胞、破骨细胞内表达呈强阳性。7天组压力侧牙槽骨破骨细胞减少，透明样变区减小；IL-8在牙周组织内的表达开始下降；14天组牙槽骨以成骨明显，破骨细胞明显减少；IL-8在牙周组织内的表达继续下降(如图5～14)。
　　2.3 IL-8在牙周组织中表达的半定量分析：在牙周组织中，各实验组IL-8表达的阳性细胞面密度值(Area Density,AD)结果见表1，如图9。牙周炎对照组大鼠第一磨牙牙根压力侧成纤维细胞胞浆内IL-8呈少量阳性表达，正畸力作用下，压力侧牙周组织中IL-8的表达增强，呈先增后减的规律，加力第5天达到峰值，7天时开始减弱，14天时IL-8表达持续降低，表明随着时间的延长，周膜内环境处于恢复及重建状态。炎症加力1、3、5、7天组与牙周炎对照组比较，具有统计学差异(P＜0.05)，炎症加力14天组与空白对照组比较，IL-8在牙周组织内的表达继续下降，但强度高于正常对照组，具有统计学差异(P＜0.05)。
　　3讨论
　　正畸牙齿移动是一个复杂的生物学过程，它是由许多不同的组织、细胞和分子共同作用的结果[4]。当正畸牙受力后激活牙周组织内的成骨细胞和破骨细胞，产生一系列的生物学信号(包括前列腺素、神经递质、细胞因子、白介素系列等)传导[5]，从而导致牙周膜和牙槽骨改建，压力侧牙槽骨吸收，张力侧牙槽骨增生，牙周系统达到一个新的动态生理平衡[6-7]。故正畸牙移动实质是一个慢性炎性反应过程，而牙周组织的改建过程实际上是一个动态生理平衡的过程。
　　白细胞介素-8(Interleukin-8,IL-8)是一种内源性趋化因子，通过趋化和活化PMN，促进炎症介质的释放，加重局部炎症反应，是反映牙周炎症状态的重要参数。在IL-1、TNF-α、LPS等刺激下，单核细胞、巨噬细胞、牙周膜成纤维细胞等[8-9]都能产生IL-8；与IL-1β、IL-6及TNF-α类似，参与机体炎症反应。同时IL-8作为一种破骨细胞活化因子，加剧牙槽骨的吸收，并抑制牙周膜的修复和代谢功能，促进炎症介质的释放，加重局部牙周组织的炎症反应，影响牙周组织的改建，是骨吸收的标志物之一[1]。
　　1995年Fitzgerald[10]报道在慢性牙周炎组织中有IL-8抗原及IL-8mRNA表达。随后谢昊[11]等检测发现，在牙周炎患者血清中IL-8的检出率(47%)明显高于在健康对照组血清中的检出率(7.7%)，不仅证实健康牙周组织中有IL-8存在，还发现在75%牙周病变组织中均可检出IL-8。说明IL-8与牙周炎症疾病的发生发展是密不可分的。IL-8作为牙周炎组织中的一种重要的炎症介质，在牙周组织接触牙周病原菌后，PMN释放溶菌酶，可加重局部炎症反应，诱导IL-8的大量释放。
　　本实验用丝线结扎配合高糖喂养建立牙周炎模型。丝线结扎刺激牙龈，同时结扎也起到菌斑固定的作用；在高糖饲养的条件下，食物更易发酵变酸，导致细菌沉积增多，加速炎性细胞释放的增多，刺激破骨细胞数目增多。实验中发现在正常第一磨牙牙周组织中IL-8仅少量表达，但在炎症条件下，第一磨牙压力侧牙周组织中IL-8表达增强，在破骨细胞、牙周膜成纤维细胞浆中呈高强度表达。牙周炎大鼠的牙周组织中IL-8表达强度显著高于正常对照大鼠，且牙槽骨内骨吸收陷窝较正常牙周组织明显增多，提示IL-8具有促进破骨活性。由此可见IL-8与炎症密切相关，同时IL-8的表达变化也反映牙周炎症的病变进程。
　　Eskan[12]等认为IL-8作为IL-1β的“次级产物”，而IL-1和TNF-α调节IL-8表达的方式相同[13]，IL-8可能协同IL-1β、TNF-α等其他细胞因子共同参于炎症反应。当炎症加力后，破骨细胞增多、IL-8表达增强，提示力学信号可能启动了破骨细胞募集、分化、成熟及发挥骨吸收功能的新的循环。在炎症加力组，IL-8表达仍在5天时达到高峰，破骨细胞、牙周膜成纤维细胞的胞浆的阳性信号明显增强，IL-8的上调与近中压力侧的骨吸收增加呈现一致性。接近牙槽嵴顶区域IL-8表达更强，破骨陷窝更多，原因可能是倾斜移动使此部位应力集中，使骨面弯曲形变的压力效应启动新的信号传导，也可能与其接近牙周袋或龈沟底、更易受炎性物的侵袭有关。在炎症加力组中，由于慢性炎症环境的存在，正畸力加力后，加剧了牙槽骨吸收的程度，破骨细胞数目较炎症对照组明显增多，在受压的牙槽骨大量聚集，骨吸收加重，与肉眼观察到的牙移动速度加快相一致。因此，对于成人正畸患者，尤其是牙周炎性受损患者，治疗前应作牙周健康状况评价，在正畸牙移动中避免炎性物质对牙周组织的侵袭，控制牙周炎症反应，及时去除局部刺激因素，选择合适的正畸力，提高正畸治疗的效率。
　　在正畸加力后，牙周组织中IL-8含量的变化可能反应了相应区域牙周组织炎症状态和骨吸收情况。本实验对IL-8在各组大鼠牙周组织的表达进行了分析，结果显示：当正畸加力后，破骨细胞、牙周膜成纤维细胞内IL-8的表达呈阳性且不断增强，加力5天时达到峰值，之后缓慢下降，在加力14天时基本恢复正常。加力后IL-8主要表达于牙周膜成纤维细胞、破骨细胞和血管内皮细胞，其中以牙周膜成纤维细胞和破骨细胞的阳性表达最强。肖立伟[14]等研究认为炎性牙周组织受到正畸力作用下，TNF-α在牙周组织中的表达也呈现出先增后减的规律，14天时基本恢复正常，表达强度仍高于空白对照组。本研究表明当正畸力作用于伴有牙周组织炎症的牙齿时，可引起IL-8释放的增多，牙周炎症状态与正畸力作用发生效应叠加，加重了牙周组织的炎症反应程度，但炎性细胞因子在牙周组织内的表达仍有自限性，在牙移动中后期，牙周组织原有的炎症消退而逐渐下降，牙槽骨吸收减少，不会引起牙周组织的过度破坏。
　　本实验在力学及炎性刺激的联合效应下，分析IL-8在牙周组织中的表达规律：处于牙周炎慢性期的大鼠磨牙在受到近中向的正畸牵引力后，IL-8的表达随时间呈先�后减的规律，表达水平高，持续时间长，揭示在炎症时受正畸力作用下，牙周组织的炎症反应程度加重。
　　
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　　[收稿日期]2011-03-11[修回日期]2011-04-25
　　编辑/何志斌