低氧对人脐带间充质干细胞成脂肪分化的影响_脐带间质干细胞骗局

　　[摘要]目的：研究低氧（2%O2）对人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs）成脂肪分化的影响，为脂肪组织工程种子细胞的筛选提供实验依据。方法：培养条件有低氧（2%O2）、常氧（20%O2）、10%FBS完全培养基（GM）、10%FBS成脂培养基（DM）；将第3代hUCMSCs根据培养条件分为3组，对照组（常氧+GM 5天，常氧+DM 2周）、实验组1（低氧+GM 5天，低氧+DM 2周）、实验组2（低氧+GM 5天，常氧+DM 2周）；在诱导后2周分别进行油红O染色并观察其成脂效率。结果：与对照组相比，实验组1脂肪样细胞数量明显减少，实验组2脂肪样细胞数量明显增加。结论：将hUCMSCs预先进行低氧处理再转换为常氧培养可显著提高其成脂分化能力。
　　[关键词]低氧；人脐带间充质干细胞；分化
　　[中图分类号]Q813.1R644[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2011）07-1100-03
　　
　　Effect of hypoxia on the adipogenic defferentiation potential of human umbilical cord mesenchymal stem cells
　　TANG Jun1,XU Bin2,LIU Yi2
　　(1.The Second Clinic Medical College of Lanzhou University,Lanzhou 730000,Gansu,China；2.Center of Military Burns and Plastic Surgey,Lanzhou General Hospital of Lanzhou Command of CPLA)
　　
　　Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of hypoxia on the adipogenic defferentiation potential of human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUCMSCs),and provide experimental evidence for selecting seeded cells of adipose tissue engineering.MethodsThe cultural conditions includes hypoxia（2%O2）, normoxia（20%O2）, 10% FBS growth medium（GM）, 10% FBS adipogenic defferentiation medium（DM）；hUCMSCs were cultured in vitro and divided into three groups according to the cultural conditions: control group(normoxia + GM 5d，normoxia + DM 2 weeks),experimental group 1(hypoxia + GM 5d,hypoxia + DM 2 weeks),experimental group 2(hypoxia + GM 5d,normoxia + DM 2 weeks). After 2 weeks of culture,the three groups were stainedby oil red O.ResultsCompared with control group,the number of the fat-like cells decreased obvously in experimental group 1,but the number of the fat-like cells increased significantly in experimental group 2.ConclusionshUCMSCs pre-exposed to hypoxia when switched to normoxia exhibited significantly higher adipogenic defferentiation capacity.
　　Key words: hypoxia;human umbilical cord mesenchymal stem cells; defferentiation
　　
　　低氧是影响间充质干细胞（MSCs）生物学特性（包括生存、增殖、分化、迁移等）的一种重要的微环境因素，并在MSCs增殖与分化的平衡中扮演着重要角色。目前，关于低氧对MSCs生物学行为影响的研究主要集中于短期或长期低氧培养促进增殖与迁移；此外，国内外学者也有报道，不同氧浓度可降低或刺激MSCs成脂、成骨、成软骨分化能力[1-3]。本研究以人脐带间充质干细胞为对象，探讨低氧（2% O2）对其成脂肪分化的影响，为脂肪组织工程种子细胞的筛选提供实验依据。
　　
　　1材料和方法
　　1.1材料：健康足月顺产胎儿脐带（兰州军区兰州总医院妇产科）均经父母授权同意，DMEM/F12（Gibco公司），胎牛血清（兰州民海生物工程有限公司），胰蛋白酶、地塞米松、吲哚美辛、胰岛素、IBMX、油红O（Sigma公司），CO2恒温培养箱（Heracell），低氧培养箱，超净工作台（杭州净化有限公司），倒置相差显微镜（Olympus公司），流式细胞仪（美国BD公司）。
　　1.2方法
　　1.2.1hUCMSCs的分离与培养：按本实验组建立的方法分离与培养hUCMSCs[4-6]。
　　1.2.2细胞免疫表型的测定：用流式细胞仪对第3代（P3）hUCMSCs表面抗原进行检测。0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA的消化液消化待检细胞,PBS 洗涤3 次,制成1×105/ml的细胞悬液。流式细胞仪测定表面抗原CD29、CD34、CD44、CD45、HLA-ABC、HLA-DR表达情况。
　　1.2.3hUCMSCs的低氧处理：参照Valoani等[7]的方法处理并稍作修改，将P3代hUCMSCs以1×104/ml密度接种于含有10%FBS的DMEM/F12完全培养基的培养皿（直径60mm）中，待细胞完全贴壁后，对照组、实验组1和实验组2分别给予常氧（20%O2）、低氧（2%O2）和低氧（2%O2）处理5天，中间换一次液，各3个复组。
　　1.2.4低氧培养条件下hUCMSCs的成脂肪分化：将上述培养5天的hUCMSCs的培养基更换为含10%FBS的DMEM/F12成脂诱导培养基进行成脂诱导分化，对照组、实验组1和实验组2分别给予常氧（20%O2）、低氧（2%O2）和常氧（20%O2）处理，诱导培养2周，每3天换一次液。
　　诱导培养2周后，将对照组、实验组1和实验组2分别进行油红O染色观察。
　　1.2.5统计学方法：应用SPSS13.0统计学软件对数据进行t检验分析，P 　　
　　2结果
　　2.1hUCMSCs体外培养的形态学特点：在5～7天时，在倒置相差显微镜下可观察到成纤维状细胞从脐带组织块周围爬出，14～16天细胞可达80%以上融合，连续传至15代未见细胞形态有明显改变（见图1）。
　　2.2hUCMSCs免疫表型分析：流式细胞仪检测结果显示（见图2），贴壁细胞均表达CD29、CD44、HLA-ABC，不表达造血细胞表型CD34、CD45，不表达免疫排斥相关表面标记HLA-DR，由此初步说明,从脐带分离出来的贴壁细胞为间充质干细胞。
　　2.3 hUCMSCs的低氧处理后的观察（见图3）：可见对照组（见图3A）、实验组1（见图3B）和实验组2（见图3C）分别给予常氧（20%O2）、低氧（2%O2）和低氧（2%O2）处理5天后，细胞形态无明显差异，但实验组细胞增殖数目明显多于对照组。
　　2.4 低氧培养条件下hUCMSCs的成脂肪分化观察（见图4）：各组加入成脂诱导培养基培养后，hUCMSCs形态由梭形逐渐变多角形、圆形，随培养时间的延长，部分细胞的细胞核周围出现一些折光性强的圆形脂肪小滴，脂肪滴逐渐增多，部分融合成大脂滴。油红0染色可见细胞内有橙红色的圆形脂肪滴，大小不等，有的融合成较大脂肪滴。与对照组（见图4A）比较，实验组1（见图4B）脂肪样细胞数量明显减少，约为对照组的(O.6±0.1)倍(P