气管有犬鸣声 [组织工程化犬气管的生物力学研究]

　　[摘要]目的:通过检测不同方法处理的脱细胞犬气管基质在无载荷及零应力状态下的张开角和残余应变,并对组织工程化气管的力学性能进行初步探讨。方法:取犬的第5～10气管环,分别进行酶消化法和深低温冷冻法处理,测量制成的脱细胞犬气管基质与新鲜气管在无载荷及零应力下的张开角及残余应变。结果:新鲜犬气管的张开角大于2组脱细胞犬气管基质的张开角,其差异具有统计学意义。酶消化法脱细胞犬气管基质的张开角及残余应变大于深低温冷冻组,其差异具有统计学意义。结论:不同方法脱细胞处理后,犬气管的径向支撑性能将受到影响,其中酶消化法构建的组织工程气管基质抗压缩能力优于冷冻法处理组的气管基质。
　　[关键词]组织工程;犬;气管;生物力学;张开角
　　[中图分类号]R318 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455(2010)07-1015-03
　　
　　Biomechanical research of tissue engineered canine trachea
　　ZHANG Wen-hao1,HUO Ran1,LI Shang-bin2,YU Qing-ping3,ZHAO Yang1,GAO Feng1
　　(1.Department of Cosmetology and Plastic and Burn, Provincial Hospitial Affiliated to Shandong University,Jinan 250021,Shandong, China; 2.Department of Nuclear Medicine, Provincial Hospitial Affiliated to Shandong University; 3. Heze Municipal Hospital of Shandong Province)
　　
　　Abstract:ObjectiveTo find the basic mechanical properties of tissue engineered trachea by detecting the opening angles and residual strains of acellular matrix of canine tracheas in the no-load and zero-stress states.Methods The 5th～10th tracheal rings below thyroid cartilage of canine were respectively treated with modified Courtman enzyme digest method and cryopreserved method. Then detect the opening angles and residual strains of these two acellular matrix groups and fresh trachea group in the no-load and zero-stress states.ResultsThe opening angles of fresh trachea group were larger than those two acellular matrix groups with statistical difference. The opening angles and residual strains of modified Courtman method group were larger than cryopreserved method group with statistical difference. ConclusionBoth modified Courtman method and cryopreserved method can influencethe radial sustain of canine tracheas, the tissue engineered acellular matrix treated with modified Courtman has a better anti- compressibility than cryopreserved tracheal acellular matrix.
　　Key words:tissue engineering; canine; trachea; biomechanics; opening angle
　　
　　各种原因如创伤、肿瘤等引起的长段的气管缺损,因吻合口张力过大而不能直接缝合时,需要用人工气管来修复,其中组织工程化气管因其在免疫排斥、材料来源等方面的优势逐渐成为气管重建外科的研究热点。组织工程化气管较为常用的去抗原方法有深低温冷冻和酶消化法。本实验主要探讨这两种方法处理后的脱细胞气管基质的生物力学性能较新鲜气管有无明显变化,并推测气管移植后的塌陷是否与处理方法的不同造成的力学性能变化有关。
　　Han[1]和Fung[2]指出零应力气管扇形体虽然不是圆形的,但是利用扇形体内壁中点与内壁两端点连线的夹角所定义的张开角依然可用来描述气管扇形体的主要特征。我们采用Han 和Fung相同的方法取得犬气管的无载荷状态和零应力状态。仔细检测犬气管无载荷状态的内、外壁周长和零应力状态的内、外壁弧长以及张开角,计算其残余应变,将深低温冷冻法和酶消化法犬脱细胞气管基质与新鲜犬气管的各项指标相比较,以研究其变化趋势,为组织工程化气管的进一步研究做力学方面的初步探讨。
　　
　　1材料和方法
　　将实验用成年犬(雌雄不限)按30mg/kg静脉注射3%戊巴比妥钠生理盐水溶液麻醉,切取颈段气管甲状软骨下第5～10环气管段,仔细剔除气管外壁结缔组织,4℃D-Hanks清洗保存备用,热缺血时间少于15min。选取直径及形态相近的气管段,分别用于新鲜气管测量、程控降温冷冻保存、改良的Courtman方法[3]气管黏膜脱细胞处理。
　　1.1 深低温冷冻组处理方法
　　1.1.1冷冻保护剂成分:胎牛血清 20%、二甲基亚砜(DMSO)10%、青霉素50U/ml、链霉素50mg/ml。
　　1.1.2 冷冻方法:所取气管段分别移入注满冷冻保护剂的无菌生物冷冻管中,每管装1个气管段,使气管段浸没于冷冻保护液中,封口后置于4℃冰箱中冷平衡30min,应用程控降温仪程序降温,降温速率为1℃/min,降至-80℃后取出,迅速放入-196℃的液氮中保存6周。测量前将冷冻管从液氮罐中取出,置入37℃恒温水浴震荡箱中,轻轻摇动,使气管段均匀快速解冻复温。
　　1.2 改良Courtman法气管黏膜脱细胞组处理方法
　　1.2.1使用1%Triton X-100和2U/ml脱氧核糖核酸酶(DNAse)、1mg/L核糖核酸酶(RNAse)联合顺序作用于气管组织,以脱去粘膜细胞。为防止蛋白酶对细胞外基质中的胶原成分产生破坏,在消化液中加入蛋白酶抑制剂(Aprotinin)和EDTA,抑制蛋白酶作用,保护胶原成分结构完整。配置消化液如下:A液:pH=8的Tris-Hcl缓冲液(1000ml含6.05g Tris碱,0.2gEDTA、10万KIU Aprotinin);B液:pH=8的Tris-Hcl缓冲液(1000ml含6.05g Tris碱,87.7gNaCl、0.2gEDTA、10万KIU Aprotinin);C液:pH=7.4的Tris-Hcl缓冲液(1000ml含10ml Triton X-100、0.2gEDTA、10万KIU Aprotinin);D液:pH=7.6的Tris-Hcl缓冲液(1000ml含有DNAseⅠ2000U、RNAseA 1mg、MgCl21.22g、CaCl21.11g)。
　　1.2.2消化步骤如下:①加入消化液A,恒温摇床4℃震荡24h,每8h更换新的消化液;②加入消化液B,恒温摇床4℃震荡24h,每8h更换新的消化液;③4℃ D-Hanks震荡洗涤4次,每次15min;④加入消化液C,恒温摇床4℃震荡24h,每8h更换新的消化液;⑤所取4℃D-Hanks震荡洗涤4次,每次15min;⑥加入消化液D,恒温摇床37℃震荡4h;⑦加入消化液C,恒温摇床4℃震荡24h;⑧4℃ D-Hanks震荡洗涤48h,4℃ D-Hanks内保存备用
　　1.3 气管无载荷状态的内、外壁周长以及零应力状态的内、外壁弧长和张开角的测量方法:用着色笔分别标明气管软骨部分和肌肉部分的中点,垂直于气管纵轴方向,将相邻软骨环之间的韧带剪断,使之成为无载荷状态的独立气管环,按顺序盛放在装有生理盐水的培养皿中,将培养皿放在扫描仪上直接扫描, 从而将无载荷状态气管环的几何信息数字化存储在计算机中。取得信息后,将气管环自扫描仪上取下,从气管环肌肉部分中点剪开,从而得到零应力状态下气管扇形体,将其放回培养皿中,静置20min,待其形态稳定后,再放回扫描仪进行扫描,从而取得零应力状态下气管环的数字几何信息(图1)。最后,运用专用图像分析软件处理扫描所得图像, 测得无载荷状态气管环和零应力状态气管扇形体的内、外壁弧长以及张开角等几何尺寸。
　　1.4 统计分析:数据经SPSS13.0软件包进行统计分析,采用单因素方差分析,组间两两比较采用Q检验(Newman-kueuls法)。采用均数±标准差(x±s)来表示,P1)有所不同。对三组标本λi、λo进行方差分析,结果可认为各组间内、外壁伸长比(λi、λo)差异均有统计学意义(P0.05) 。据此推断,经改良Courtman法脱细胞处理的气管与新鲜气管的径向抗压缩能力无显著差异,而深低温冷冻组气管径向抗压缩能力小于其余两组。
　　2.5张开角与残余应变的关系:以上分别对张开角及残余应变得分析可以看出,新鲜组气管张开角比另外两组脱细胞处理组大,不同方法脱细胞处理的两组气管基质之间张开角也有统计学差异,但经改良Courtman法脱细胞处理的气管与新鲜气管的内、外壁残余应变并无统计学意义上的差异。从整体上来比较,张开角较大的气管组其内、外壁残余应变也较大,这个结果再一次印证了Fung关于张开角是残余应变直观表示的重要论断,也与国内复旦大学柳兆荣、王忆勤[4]等对大鼠气管测量所得结果相符合。
　　
　　3讨论
　　本次实验又一次验证了气管在零载荷状态下存在残余应变,剪开后在残余应力的作用下将形成具有一定张开角的扇形体[6]。与以往国内对大鼠气管进行的实验研究结果不同点在于,以往实验结果显示,大鼠气管内壁伸长比小于1,内壁残余应变小于0,即剪开前大鼠内壁气管处于压缩状态,其内径周长小于剪开后的内弧长[4]。而本次实验结果发现所有三组犬气管标本的内壁伸长比均大于1,即从整体上看,犬气管内壁并未发现存在压缩现象。滕忠照[5]等曾做过大鼠气管两次剪开的实验,将大鼠气管肌肉部分和软骨部分分别剪开,发现除靠近气管杈的气管环外,大鼠气管的肌肉内外壁均有位拉伸状态。据此分析,由于犬气管的直径远大于大鼠气管,其肌肉部分弹性回缩很大程度上抵消掉了气管软骨部分的形变,所以在整体上计算,犬气管内壁伸长比大于1。由于犬气管与人体气管大小更接近,这一结果将有助于对人气管的力学性能的进一步研究。
　　Fung指出[6],活组织生长取决于应力,在一定压力载荷下,气管将产生适应性生长,使其与所处的力学环境相适应,气管张开角是残余应变的直观表示,可以用张开角来定量表示气管的残余应变[4],并进一步推断其径向抗压缩能力。从本次实验结果可以看出,新鲜气管的张开角明显大于进行脱细胞处理后的两组气管基质。这说明将气管进行脱细胞去抗原处理的过程中,各种物理及化学因素将对气管的抗压缩性能产生一定程度的不利影响。而本次实验所采用的两种脱细胞方法对气管的抗压缩性能产生的影响也不尽相同。以往对于气管移植的研究主要集中在去抗原处理[7-10]上,而在处理过程中可能会造成气管径向抗压缩能力下降并未引起人们过多重视,对于术后气管的塌陷也大多从免疫反应及血液供应等方面考虑,对气管本身支撑能力下降并未有明确研究,本实验对不同方法处理后犬脱细胞气管基质的支撑性能的初步研究,可望为以后组织工程化气管的进一步研究提供力学方面参考。
　　
　　[参考文献]
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　　[收稿日期]2010-04-21 [修回日期]2010-06-25
　　编辑/张惠娟