人体电磁场频率_80430极低频率电磁场对肝癌细胞Bax和Bcl-2基因表达的影响

　　[摘要] 目的 研究极低频率电磁场(Extremely Low Frequency Electromagnetic Field，ELF)对肝癌细胞Bax和Bcl-2基因表达的影响，探索ELF在治疗肝癌中的作用。方法 以正常的肝细胞L-02为对照，通过Real-timePCR和流式细胞仪(FCM)方法检测经过ELF处理过的肝癌细胞系BEL-7402的Bax和Bcl-2基因表达情况。结果 经ELF处理后BEL-7402细胞Bax基因表达明显上升，而Bcl-2基因表达显著下降，对L-02细胞则没有影响。结论 ELF能够上调促进凋亡基因Bax在肝癌细胞中的表达、下调抑制凋亡基因Bcl-2的表达，提示EMF促进肝癌细胞凋亡方面具有重要作用，为EMF在临床治疗肝癌提供了线索。
　　[关键词] 肝细胞癌； BAX； bcl-2； 基因表达； 凋亡
　　[中图分类号] R735.7[文献标识码] A[文章编号] 1005-0515（2011）-11-046-02
　　
　　肝细胞癌(HCC)为原发性肝癌，在我国是最常见的恶性肿瘤之一，目前临床上仍然没有什么有效的治疗方法。极低频率电磁场(ExtremelyLowFrequencyElectromagneticField，ELF)是一种新兴的治疗肿瘤的方法[1]，已经有报道显示，ELF对于许多恶性肿瘤都有一定的治疗效果，但是ELF治疗恶性肿瘤的机制，特别是分子机制不甚明了[2-5]。本研究试图通过分析ELF对肝癌细胞系BEL-7402和正常肝细胞系L-02中Bax和Bcl-2基因表达的影响，揭示ELF对肝癌细胞凋亡相关基因影的表达响，从而探寻ELF在肝癌治疗方面的分子机制。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 标本 肝癌细胞系BEL-7402以及正常肝细胞L-02购自sigma公司。
　　1.1.2 RNeasyMiniKit试剂盒 购自QIAGEN公司产品，Bax、Bcl-2、β-actin引物购自南京金思特科技有限公司，RT试剂盒购自Tiangen公司，Real-timePCR试剂盒购自Tiangen公司，鼠抗人Bax和Bcl-2抗体购自sigma公司。
　　1.2 方法
　　1.2.1 细胞培养的方法 用含10％胎牛血清，100U/ml的青霉素，100U/ml的链霉素的RPMI-1640培养液中，置37℃，饱和湿度5%的CO2培养箱中培养，传代，当细胞生长活力良好时使用。
　　1.2.2 EMF对肝癌细胞的处理 低频率电磁场由武汉市海军工程学院提供(型号:DL―D03)。额定电压220V,单相频率100Hz,由可调变压器及电阻调节输出磁场强度。将肝癌细胞系BEL-7402与胎肝细胞(L-02)接种到孔板中,并置于磁场强度分别为0.9mT的磁场中进行干预,每天刺激2次,每次1h,作用3天。
　　1.2.3 总RNA提取、纯化与RT-PCR 按说明书用TRIzol提取肝癌细胞系BEL-7402与正常肝细胞L-02中的总RNA，通过紫外分光光度计检测RNA的产量并检测RNA的纯度。以此RNA为模板，70℃灭活10min，加入10mmol/Loligo(dT)18,dNTP以及AMV逆转录酶，5xAMV逆转录酶缓冲液等，合成cDNA。然后加入Bax，Bcl-2,β-actin引物，分别进行PCR扩增。Bax上游引物序列：5’一CGGCGAATTGGAGATGAA一3’；下游引物序列：5’一GTGTCCACGTCAGCAATCAT一3’；Bcl-2上游引物序列：5’一CATGCCGTCCTTAGAAAAATACA一3’；下游引物序列：5’一CTGCTTTTTATTTCATGAGGTACATT一3’；β-actin上游引物序列：5-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′；下游引物序列：5-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′。PCR扩增条件：94oC预变性2min，然后94℃3Osec，55oC40sec，72oC30sec共40个循环，最后72oC10min。以6ul扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，β-actin检测逆转录效率，以凝胶成像系统摄像并分析。
　　1.2.4 FCM检测 Bax和Bcl-2蛋白的表达：收集ELF作用后的细胞，70%冷乙醇固定2h,PBS洗涤2次，鼠抗人Bax和Bcl-2单克隆抗体室温固定30min,PBS洗涤2次，加入二抗为FITC标记的羊抗鼠或羊抗兔IgG避光染色30min。同时设阴性对照用PBS代替一抗和二抗，同型对照组只加入二抗。流式细胞仪测定荧光强度。以荧光指数(FI)表示蛋白的表达情况，FI=(样本蛋白荧光强度-同型对照的荧光强度)/正常对照的荧光强度。
　　1.2.5 统计学处理 用SPSS11.5统计软件进行统计学分析，结果中的定量数据用均数±标准差(x±s)表示,两组均数间比较采用t检验，样本间率的比较采用Fisher精确概率法计算X2值(双侧)。P≤0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 Real-time-PCR检测 Bax和Bcl-2基因表达结果。Real-timePCR的结果可以看到:各组实验样品的扩增曲线见图1；各组实验样品的溶解曲线见图2。BEL-7402细胞经过ElF处理后，与未处理组相比较，Bax的表达明显上升：由0.09852±0.003117升高至0.169676±0.004860(P＜0.05)；Bcl-2的表达明显下降：由0.091253±0.003849降低至0.052458±0.002457(P＜0.05)图3；
　　图1 样品扩增曲线
　　图2 样品溶解曲线
　　 图3 ELF对肝细胞Bax及Bcl-2表达的影响
　　2.2 FCM检测 Bax和Bcl-2蛋白表达的结果：ELF处理后，L-02细胞Bax和Bcl-2蛋白表达无明显差异，而BEL-7402细胞Bax和Bcl-2蛋白表达有明显的下降(P 　　Bax与Bcl-2基因均属于Bcl-2家族,它们分别是Bcl-2家族中最有代表性的抑制凋亡和促进凋亡基因,在肿瘤细胞凋亡中具有重要的调控作用。Bax基因是1993年Zoltan等用免疫沉淀法在人前B细胞基因库中发现的一种新基因,定位于染色体19q13.3-19q13.4,其编码的Bax蛋白分子量为21KD,由192个氨基酸组成。Bax蛋白主要位于细胞质中，是主要的促凋亡蛋白，具有拮抗Bcl-2蛋白抑制凋亡的作用。Bcl-2基因位于染色体18q21。Bcl-2蛋白由239个氨基酸组成，相对分子量为26KD,Bcl-2蛋白主要位于线粒体膜、核膜和内质网,对细胞增殖速度不产生影响，而是通过抑制多种因素诱导的细胞凋亡，延长细胞寿命，导致细胞数目增多，而使遗传物质的突变率增加，从而增加了肿瘤发生的机会[7]。Bcl-2蛋白在绝大多数肿瘤组织中的表达高于其起源组织[3]。细胞基因转染，转基因鼠和基因敲除鼠的研究均表明，Bcl-2过表达能够抑制多种因素诱导的多种细胞调亡，Bax过表达不仅可使多种细胞发生自发调亡，而且也可以促进许多因素诱导的多种细胞凋亡[8]。Bcl-2/Bax在细胞中以二聚体形式发挥作用，Bcl-2/Bax即可形成异二聚体，又可形成同源二聚体，如二者表达量平衡则细胞生存期正常，当Bcl-2表达量较高时，Bcl-2/Bax形成异源二聚体，抑制细胞凋亡；当Bax表达量较高时，Bcl-2/Bax形成同源二聚体，促进细胞凋亡[9]。
　　以往的研究发现，肝癌组织中Bcl-2蛋白呈较高程度的表达，Bax蛋白出现表达水平下降，而且无论Bcl-2蛋白阳性率还是Bax蛋白阳性率，正常肝组织较肝细胞癌组织都有统计学意义[10]。本实验的结果发现经过ElF处理过的BEL-7402细胞Bax的mRNA及蛋白的表达有所上升，而Bcl-2则有下降的趋势。说明ELF具有一定的调节Bax及Bcl-2基因表达的能力并促进BEL-7402细胞的凋亡。本研究中，ELF能够促进抑制凋亡基因BAX、Bcl-2在肝癌细胞中的表达下调，提示EMF促进肝癌细胞凋亡方面具有重要作用，为EMF在临床治疗肝癌提供了线索和治疗靶点。
　　参考文献
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