【不同浓度的ＩＬ－１β和ＴＧＦ－β１对大鼠肋软骨细胞的影响】 IL-10的正常浓度

　　[摘要]目的：研究人白细胞介素-1β（IL-1β）和转化生长因子-β1(TGF-β1)对体外培养的SD大鼠肋软骨细胞功能的影响。方法：采用免疫组织化学检测不同剂量IL-1β和TGF-β1作用48h后软骨细胞Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达水平。采用RT-PCR方法检测细胞Ⅱ型胶原、aggrecanase-1,2、aggrecan的 mRNA的表达水平。结果：IL-1β可以促进软骨细胞aggrecanase-1,2的表达，从而降低多聚蛋白聚糖的含量，破环细胞外基质结构，减少II型胶原的含量，使细胞呈现去分化的表现，对软骨细胞起负性调节作用。低浓度的TGF-β1对软骨细胞起保护的作用；高浓度的TGF-β1（100ng/ml）在促进蛋白多糖表达的同时也促进软骨细胞蛋白多糖的降解，从而打破软骨的代谢平衡，起负性调节的作用。
　　[关键词]IL-1β；TGF-β1；软骨细胞
　　[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2008）08-1166-05
　　
　　The effects ofIL-1β and TGF-β1 on rat costochondral chondrocytes
　　WANG Li, WANG Zheng-hui, YANG Zhuang-qun, LI Li-xia, TU Jun-bo, LI Guo-guang
　　(Department of Oral and Maxillofacial Plastic Surgery, Stomatological Hospital, Xi"an Jiaotong University, Xi"an 710004, Shaanxi, China)
　　
　　Abstract:ObjectiveIn order to study IL-1βand TGF-β1 have what effects on SD rat chondrocyte cell.MethondsDifferent dosis of IL-1βand TGF-β1 was used to deal chondrocyte cell 48 hours.Then aggrecan and collagen II of those celluar and the control group were detected by immune-histochemistry. RT-PCR methondwas used to assessment celluar aggrecan and collagen II and aggrecanase-1,2 mRNA expressing.ResultsIL-1βincreases the expressing of aggrecanase-1,2 accordingly decrease the content of aggrecan, reduce the celluar character collagen II ,destroy the integrity of ECM. IL-1βhave negative effects on chondrocytes. Low-grade TGF-β1 have energetic effects on chondrocytes, altus improve the content of aggrecan also degration the aggrecan ,finally breakdown the balance of ECM, have negative effects on chondrocytes.
　　Key words：IL-1β; TGF-β1; chondrocytes
　　
　　在整形外科领域，软骨组织的缺损修复以及重建一直是一个难题。 组织工程概念的提出为整形外科领域提供了一种新的策略。将体外扩增的软骨细胞接种至合适的支架材料上进行培养，以获得组织工程软骨。然而，体外扩增的软骨细胞存在着去分化的现象，机制不明。细胞因子在影响细胞分化方面起着重要的作用，其中IL-1，TGF-β1的作用研究较多，但是各个学者看法不一。本文采用免疫组织化学染色， RT-PCR等方法探讨IL-1β和TGF-β1对软骨细胞Ⅱ型胶原，多聚蛋白聚糖酶-1,2(aggrecanase-1,2) 及蛋白多糖(aggrecan)表达量的影响。
　　
　　1材料和方法
　　
　　1.1 材料：体重约120g的雌性SD大鼠（由西安交通大学动物中心提供）。主要试剂与仪器：高糖 DMEM培养基、胎牛血清（ Invitrogen公司）； 胰蛋白酶（Sigma公司）、透明质酸酶、Ⅱ型胶原酶、阿尔新蓝8GX（Sigma公司）；小鼠抗大鼠Ⅱ型胶原单克隆抗体（Neomarker公司）；羊抗大鼠aggrecan单克隆抗体 （Santa Cruz公司）；DAB免疫组织化学试剂盒（北京中杉公司） ；RNA提取试剂盒（上海飞捷公司）；Revertaid First strand CDNA synthesic Kit(MBI)；正置、倒置相差显微镜及显微摄影系统（Nikon）；二氧化碳培养箱等。
　　1.2 实验方法
　　1.2.1 SD大鼠肋软骨细胞的分离培养[1]：SD 大鼠颈椎脱臼法处死，浸泡于70%的酒精中消毒15min。无菌操作台中取其肋软骨组织，剥离软骨膜，之后放入10ml的螺口瓶中用眼科剪剪至1mm3左右的组织块。采用三步法消化，获得软骨细胞, 37℃,5%CO2恒温培养箱中进行培养。传代培养采用0.25%胰蛋白酶和0.02%的EDTA（比例为1:1）进行消化，25�2培养瓶接种密度为105/ml。采用SP法进行蛋白多糖和II型胶原免疫组织化学染色，确认为软骨细胞。本实验所采用的是2代肋软骨细胞。
　　1.2.2 不同浓度的IL-1β和TGF-β1作用于软骨细胞：IL-1 β和TGF-β1分为以下浓度：1ng/ml,10ng/ml，100ng/ml 。具体实验步骤如下：①以5×104的密度接种于24孔培养板中，每孔加入1.5ml含有不同浓度IL-1β、TGF-β1的培养液。每一浓度3孔，另设3孔对照。以1×105密度接种于6孔板中，每孔加入2ml含有不同浓度IL-1β、TGF-β1的培养液。
　　1.2.3 免疫组化[2]：采用免疫组化二步法试剂盒。取2代80%融合软骨细胞玻片，PBS洗涤，4%多聚甲醛固定30min，PBS洗涤3×3min；85%、95%和100%乙醇脱水，用中性树脂将盖玻片无细胞面贴在载玻片，风干。0.3%H2O2室温20min，PBS洗涤3×3min；加入一抗(稀释度1:200)，4℃冰箱过夜，PBS洗涤3×3min；加入二抗为生物素化IgG(1∶400)，37℃30min, PBS洗涤3×3min；DAB显色，常规封片。
　　1.2.4 RT-PCR检测collagen II，aggrecanase-1,2及aggrecan的表达情况：用细胞刮刀刮下细胞，按RNA提取试剂盒说明提取总RNA。RT-PCR方法检测不同浓度的IL-1β、TGF-β1作用后的软骨细胞的collagen II，aggrecanase-1,2及aggrecan的mRNA 表达水平，同时用β-actin作为内参对照(表1)。
　　逆转录为cDNA的总体积为20μl。取3μl的cDNA进行PCR，其总体积为25μl[2]。PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。凝胶扫描分析目的基因灰度值，以β-actin为参照，计算相对OD值。相对OD值（%）=目的基因强度/β-actin 基因强度。
　　1.2.5 统计学分析：所有结果均采用x±ｓ表示，用 one-way Anova 分析比较组间差异，用统计软件包进行统计分析, 以P＜0.05表示有统计学差异。
　　
　　2结果
　　
　　2.1形态学观察：倒置显微镜下观察，肋软骨原代细胞24h 贴壁，并有少量的细胞开始伸展，完全伸展的细胞呈现不规则的多角形，折光性强，约5～7天可铺满培养瓶进行传代。传代细胞约6h 就可贴壁且有细胞伸展的现象，约3～4天就可进行传代。
　　2.2免疫组织化学染色观察：不同浓度IL-1β作用后的软骨细胞的蛋白多糖和胶原的表达量不同。随着IL-1β浓度的增高，aggrecan、collagen II的含量明显减少（图1、2）。低浓度的TGF-β1作用后的软骨细胞的蛋白多糖含量变化不大，高浓度的TGF-β1作用后的蛋白多糖含量高于对照组。TGF-β1作用后的细胞collagen Ⅱ的含量较对照组均有不同程度的降低，10ng/mlTGF-β1组降低的最为明显（图3、4）。
　　2.3 RT-PCR结果：随着IL-1β浓度的增加，aggrecan，collagen II的含量明显降低，其结果具有统计学意义（P＜0.05）。IL-1β作用后的软骨细胞的aggrecanase-1,2 的表达比对照组高，但不成比例变化。以10ng/ml的IL-1β作用效果最强（图5A）。
　　TGF-β1对软骨细胞的作用没有规律性，具体表现为：①随着TGF-β1 浓度的增加，软骨细胞aggrecan 的含量呈现增加的趋势，但低剂量组（1ng/ml和10ng/ml）比对照组的含量低，无统计学意义(P＞0.05)，100ng/ml组比对照组的含量略高，有统计学意义（P＜0.05）；② TGF-β1刺激后的软骨细胞aggrecanase-2的含量比对照组多，以1ng/ml的最为显著，而aggrecanase-1的含量变化比较复杂，由图5B可见 1ng/ml 和10 ng/ml TGF-β1刺激组的aggrecanase-1的含量较对照组低，100 ng/ml TGF-β1刺激组的aggrecanase-1的含量则明显高于对照组(P＜0.05) ；③各浓度的 TGF-β1作用后的细胞collagen Ⅱ的含量小于对照组，但没有统计学意义（P＞0.05）。
　　
　　3讨论
　　
　　软骨组织是由细胞外基质和包埋于其中的软骨细胞组成。细胞外基质是由高度水化的蛋白多糖和胶原分子组成。软骨组织不像其他组织，其软骨细胞并不是紧密相连，而是位于蛋白多糖形成的软骨陷窝内，借助于蛋白多糖获取营养物质及排出代谢产物，因此蛋白多糖在软骨细胞的生长，分化和增殖中起着十分重要的作用。多聚蛋白聚糖酶主要是aggrecanase-1,2可以分解蛋白聚糖[3]，引起细胞外基质的变化，从而影响细胞的生长和分化等。细胞外基质中还存在着大量对细胞的生长、分化、代谢和凋亡进行调控的生长因子，如IL-1β,TGF-β1,ΒMP，FGF 等。一般认为IL-1β起着抑制软骨细胞增殖的作用，ΒMP，FGF起促进软骨细胞增殖的作用[4]。但是对于TGF-β1 对软骨细胞所起的作用，各个学者意见不一。Denuziere A和 Morales TI 等认为TGF-β1可以促进蛋白质的合成以及关节软骨细胞的增殖[5-6]，在关节软骨ECM的降解中起着非常重要的作用。De Haart 等[7]研究证实TGF-β1 可以促进原代及一代软骨细胞的增殖，但是对第三代的软骨细胞刺激作用减弱。
　　IL-1主要由单核细胞合成， 分子量为17KD的蛋白质，有a,β两种类型。IL-1a为酸性型，等电点为5.0，IL-1β为中性型，等电点为7.0。其中IL-1β是构成细胞外基质中IL-1的主要成份[8]。以往有研究表明IL-1β是一种负性调节因子，可以引起软骨基质的降解，促进软骨的破坏。我们的实验结果显示IL-1β作用后的软骨细胞aggrecan、collagen 的含量明显比对照组少，而aggrecanase-1,2的含量比对照组高。说明IL-1β可以促进aggrecanase-1,2的表达，从而降低多聚蛋白聚糖的含量，破环细胞外基质结构，进一步影响细胞的生长，分化等；降低II型胶原的含量，使细胞呈现去分化的表现，这与Mathieu P等的研究结果一致[9]。
　　
　　
　　TGF-β1为 25KD的蛋白质，由两条肽链经二硫键连接而成，是一种对多种类型的结缔组织具有复杂生物学效应的生长因子[10]，具有多重的生物学效应。目前关于其对软骨细胞的作用，尚无定论。有学者研究证实TGF-β1可以促进蛋白质的合成[5]，促进关节软骨细胞的增殖。Jong Eun Lee等研究证实含有TGF-β微球的壳聚糖支架材料与对照组（不含TGF-β）相比，能显著促进细胞的增殖和多聚蛋白聚糖的合成[11]。陈百成等[12]认为TGF-β在软骨细胞发育的不同阶段起着不同的作用，对软骨细胞的分化和功能具有双向的调节作用。对未分化或者分化早的细胞，促进DNA的复制，II型胶原和多聚蛋白聚糖的合成[12-13]；对分化末期的细胞起着抑制软骨细胞分化及软骨基质形成的作用[12]。Goto等将TGF-β1基因导入体外培养的软骨细胞，发现胶原及非胶原蛋白、蛋白多糖的合成明显增加[14]。 Border WA等认为TGF-β1在修复损伤的软骨中起着重要的作用，但高剂量的关节腔内注射可引起炎症细胞的趋化作用，从而引起炎症反应，导致软骨缺陷处形成纤维样组织，因此，应该控制TGF-β1的用量以减小其副作用[15-16]。在本实验中，我们发现不同浓度TGF-β作用后的软骨细胞分泌Collagen Ⅱ水平较对照组均有不同程度的降低。这一结果与Bradham DM 等的研究结果有一定的相似性[17]。Micky D等认为 aggrecanase-1在软骨细胞基质的降解中起着重要的作用，对蛋白多糖的降解负主要责任，而aggrecanase-2只是在病理情况下对蛋白聚糖的降解起辅助作用[18]。与对照组相比，1ng/ml和10ng/ml的TGF-β1减弱软骨细胞aggrecanase-1，蛋白多糖的表达，增强aggrecanase-2的表达；100ng/ml的TGF-β1同时促进aggrecanase-1，2的表达，也促进aggrecan的表达。 100ng/ml组的aggrecanase-1，2的含量均高于正常对照组，且aggrecan 的含量也高于对照组，说明TGF-β1在增加aggrecanase-1,2的同时也增加蛋白多糖的表达, 对软骨细胞起着双重作用，与Βoumediene K 等的研究结果相同[19]。
　　组织工程软骨的构建需要大量的有功能的种子细胞，但在体外培养的过程中往往存在着细胞的去分化现象，具体表现为随着培养时间延长及传代次数的增加软骨细胞蛋白多糖和II型胶原含量逐渐减少。在培养的过程中加入细胞因子，促进软骨细胞增殖的同时抑制多聚蛋白聚糖的降解，以维持软骨细胞的表型，利于组织工程软骨的构建，是一个新的研究方向。本实验从免疫组化，mRNA的水平分析了IL-1 β和TGF-β1对软骨细胞的影响，为进一步研究软骨细胞去分化奠定了基础。
　　
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　　[收稿日期]2008-04-12[修回日期]2008-07-15
　　编辑/张惠娟