新型多孔双相磷酸钙支架与兔骨髓间充质干细胞相容性的体外实验研究|磷酸钙和碳酸钙哪个好

　　[摘要]目的：研究新型多孔双相磷酸钙支架与兔骨髓间充质干细胞的体外相容性。方法：体外分离、扩增兔骨髓间充质干细胞。取传二代细胞，按照经典组织工程构建方法，分别接种双相磷酸钙(对照组)和双相磷酸钙复合纳米羟基磷灰石(实验组)支架。单纯细胞培养为空白对照组。体外成骨诱导培养14天。倒置相差显微镜、扫描电镜观察细胞生长情况；MTT法检测细胞增殖功能；碱性磷酸酶(ALP)检测细胞成骨分化功能。结果：细胞在新型支架上吸附、生长良好。各组MTT及ALP值随培养时间延长而增大。培养各时段实验组均高于其他两组，差别有统计学意义(P＜0.01)。结论：新型BCP支架与兔BMSc在体外具有良好的相容性，二者具有体外构建工程骨的潜力。
　　[关键词]骨组织工程；双相磷酸钙；纳米羟基磷灰石；骨髓间充质干细胞：细胞相容性
　　[中图分类号]Q813.1　[文献标识码]A　[文章编号]1008－6455(2007)05－0588－05
　　
　　外伤、感染、肿瘤切除导致骨质缺损在临床很常见。双相磷酸钙(biphasic calcium phosphate，BCP)作为骨替代、填充材料已被广泛研究并投入临床应用。随着组织工程概念的引入，BCP在组织工程支架领域的应用正逐渐受到重视。人工合成的纳米羟基磷灰石(nanophas hydroxyapatite，n-HA)与人体骨组织针状纳米磷灰石结构相似，从仿生学角度来说，有更好的相容性。我们以多孔BCP作为基体，将n-HA复合在支架孔隙表面，结合两种材料的优点，获得新的多孔支架。通过接种兔骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)体外共培养，初步探讨新支架材料与兔骨髓间充质干细胞的相容性，为将来结合体内实验数据对该支架材料进行客观评价提供依据。
　　
　　1　材料和方法
　　
　　2.1　主要实验材料、试剂及设备：BCP＋n－HA及HCP支架(东南大学材料工程学院提供。每块材料均制作成直径5mm，厚1.5mm的多孔圆片。BCP与BCP＋n－HA支架的平均孔径分别为500 um和450um；平均孔隙率分别为85.9％和81.9％)；DMEM－LG培养基(Gibco)；胎牛血清(杭州四季青)；人淋巴细胞分离液(上海华精)；胰蛋白酶(南京大治)；B－甘油磷酸钠(南京创瑞)；地塞米松；维生素C；MTT试剂(南京创瑞)；二甲基亚砜(南京创瑞)；TritonX－100(南京创瑞)；考马斯亮蓝检测试剂盒(南京建成)；碱性磷酸酶检测试剂盒(南京建成)；酶标仪(BioRAD－680)；培养箱(HEAL FORCE HF 212 uv)；离心机(Anke TDL－40B)；相差倒置显微镜(OLYMPUSCKX41)；扫描电镜(EDAX)。
　　
　　2.2　实验方法
　　2.2.1　兔BMSCs的分离与培养：取成年家兔一只，雌雄不限，重约2.5kg(东南大学实验动物中心提供)。戊巴比妥钠30mg／kg静脉麻醉。髂后上棘穿刺抽取深红色稠厚骨髓4ml于肝素化针管。PBS倍比稀释后按体积比1：1小心加至人淋巴细胞分离液(1.073g/ml)上。2500r/min离心30min后收集管中段的白膜带单个核细胞。PBS漂洗离心5min，1200r/min，共2次。弃上清液，用含10％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的DMEM－LG重悬细胞沉淀。血细胞计数板计数后，以2×105/cm2原代接种培养瓶。37℃，5％CO2，饱和湿度的培养箱中培养3天后首次全量换液，以后每2～3灭根据培养基的颜色全量换液。约12天，瓶底贴壁细胞汇合约80％时，0.25％胰蛋白酶溶液消化。收集并离心漂洗细胞后，以6000/cm2传代接种。培养条件相同，每2天换液1次，待瓶底细胞80％汇合时继续传代。取对数生长期的传二代细胞备用。
　　
　　2.2.2　实验分组及支架材料的准备：双相磷酸钙复合纳米羟基磷灰石(BCP＋n－HA)支架为实验组，BCP支架为对照组，每组各46块支架材料。单纯接种细胞的培养孔为空白对照组。两组支架材料分别以PBS浸泡冲洗2次，每次15min。通风吹干后，∞Co照射消毒。将各组材料用含10％FBS的DMEM－LG浸泡2h后吸去材料内的大部分培养液，再将其放入37℃，5％CO2，饱和湿度的培养箱中静置5h。
　　2.2.3　细胞与支架材料的体外共培养：取准备好的传二代细胞，用含10％FBS的DMEM－LG将其浓度调整为1.25×106/ml。24孔板每孔放置1块材料。每块材料表面滴加细胞悬液15ul后将其放入37℃，5％CO2，饱和湿度的培养箱中静置。1.5h后取出各板，以同样的方法再次接种上述细胞悬液15ul。培养箱中静置1.5h后，向每孔滴加含10％FBS的DMEM－LG，调整各培养孔液体总体积至1ml。相同条件培养24h后取出，吸弃各孔培养液，更换为等量的成骨诱导液(含有0.1bmol/L地塞米松；50ug/ml维生素C；10mmol/L β－甘油磷酸钠；10％FBS的DMEM－LG)。相同条件继续培养，每日每孔滴加维生素C5ug，每2天更换1次成骨诱导液。
　　2.2.4　形态学观察：定期相差倒置显微镜观察细胞形态，摄片。第2、7、14天，分别取出材料，PBS冲洗，2.5％戊二醛固定，乙醇梯度脱水，临界点干燥，喷金，扫描电镜观察并摄片。
　　2.2.5　四唑盐比色试验(MTT法)检测细胞增殖功能：复合培养第2、6、10、14天，各取1块培养板，每孔加入0.5％MTT溶液i00ul，孵育4h，PBS洗涤3遍。每孔加入二甲基业砜(DMSO)1ml。振荡lOmin后，吸取各孔液体150ul于96孔培养板，酶标仪于490nm波长下检测各孔光密度值。
　　2.2.6　碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)含量测定：复合培养第2、6、10、14天，各取1块培养板，吸弃培养液，PBS洗涤3遍。每孔滴加0.5％TritonX－100lml，室温下振荡20min。吸取各孔液体按照ALP检测试剂盒说明书检测相应指标。
　　
　　2.3　统计学方法：结果以(x±s)表示，实验数据经SPSSll.5软件包进行单因素方差分析，P＜O.05有统计学意义。
　　
　　3　结果
　　
　　3.1　支架材料上细胞的光镜下观察：细胞接种后第l天，两组支架孔隙表面均较光滑平整，并可见少量散在圆形透亮颗粒。从第4天开始实验组支架孔隙表面开始出现膜状透亮物覆盖，其透光度不均，随培养时间的延长逐渐增多、增厚。对照组第8天后 才逐渐出现上述变化。
　　
　　3.2　支架材料上细胞的电镜下观察：细胞接种后第2天，支架孔隙表面细胞吸附。细胞多为扁圆形及不规则形。表面光滑，单层离散分布。材料表面暴露较多。实验组吸附细胞较对照组均匀，密集，第7天，细胞逐渐伸展，形态变为多角形。细胞表面高密度圆形颗粒增多。细胞和材料表面结合更加紧密，并逐渐由原位向周围增殖，爬行。细胞间接触增多。支架孔隙结构存在，材料暴露面减小，实验组更为明显，第14天，实验组细胞形态多为长扁梭形，胞质而积较大，叠层覆盖材料面。支架孔隙结构存在，几乎无材料面暴露，大量索条状胶原和细胞胶着分布，表面可见较多大小不等的球形高密度颗粒，经能谱分析为钙盐结晶。而对照组细胞形态较实验组短小，分布不均，支架部分区域仍然裸露。但细胞覆盖区域也有胶原及钙盐结晶胶着分布。
　　
　　3.3 MTT检测结果：如表1所示，各组MTT光密度值随培养时间的延长而增大。培养各时段，实验组均高于其它两组，差别有统计学意义(P＜0.01)。对照组在第6天和第10天均低于空白对照组，差别有统计学意义(P＜0.01)，而第2天和第14天，差别无统计学意义。
　　
　　3.4 ALP检测结果：如表2所示，各组ALP检测值随培养时间的延长逐渐增大。各时间段，实验组均高于其它两组，差别有统计学意义(p＜0.01)。对照组在第2天和第6天低于空白对照组，但第10天和14天高于空白对照组，差别均有统计学意义。
　　
　　4　讨论
　　
　　优良的骨组织工程支架应具备：良好的生物相容性；适宜的生物降解性；三维立体多孔结构；可塑性和有一定的机械强度；良好骨传导性和骨诱导性。完全符合上述条件的材料尚未开发出。而生物材料的表面特性如颗粒直径、颗粒之间的孔径是影响成骨细胞存活，增殖等生理功能的主要决定因素。本实验采用的支架是在BCP支架孔隙表面复合纳米羟基磷灰石涂层，综合了两种材料的特点。新合成支架的平均孔径、孔隙率、孔隙问的相互贯通均可满足支架内营养物质的交换及细胞的长入，符合既往研究成果。
　　目前用于构建工程骨的种子细胞主要有骨膜来源成骨细胞和骨髓间充质干细胞。BMSCs的巨大优势在于；易于获取；体外可短期大量扩增；其自身部分亚群具有较强的成骨倾向，部分亚群在适当的诱导条件下更易向成骨分化；大量获取时不易造成供区部位的创伤。
　　相对于传统的以体内植入实验，体外实验快速，方法标准化，条件可控，因此具有可操作性和可比性。这使得在过去的二十年中，体外实验被广泛的应用于材料的生物相容性评价。本次实验按照经典工程组织体外构建的程序，采用二次沉淀法接种种子细胞。此外细胞接种密度会影响其增殖与分化，Haynesworth等认为细胞初始接种密度在(0.7～20)×106／ml较为合适，本次实验根据自身特点选择接种密度为1.省略