【TBX22基因多态性与非综合征性唇腭裂相关关系的研究】 唇腭裂综合征

　　[摘要]目的：探讨TBX22基因多态性与中国华东地区部分人群非综合性征唇腭裂的关系。方法：选取80个核心家庭的80例NSCL/P患儿为实验组；选取80例正常儿童作为对照组。分别提取患儿及其父母和正常儿童的外周血DNA。应用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）分别扩增TBX22基因编码区外显子3的全部序列（包含G359A、A361G突变位点），然后运用DNA测序技术，检测华东地区核心家庭的TBX22基因编码区的突变情况，分析记录基因型。根据测序所得基因型数据，比较患者组与正常儿童的基因型和等位基因频率，并对核心家庭的数据进行单倍型相对风险分析（haplotype relative risk，HRR），对父母至少一方为杂合子的核心家庭进行传递不平衡检验（transmitted disequilibrium test，TDT）。结果：TBX22基因A361G未检出多态性；G359A检测出基因多态性，实验组和对照组儿童进行病例对照研究发现基因型频数分布差异有统计学意义（P0.05）。结论：TBX22基因G359A位点多态性与中国华东地区部分人群NSCL/P的发生相关，可能是NSCL/P的易感基因。
　　[关键词]非综合征性唇腭裂；基因多态性；TBX22基因
　　[中图分类号]R782.2[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2011）06-0932-04
　　
　　Relationship between genetic polymorphism of TBX22 and nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate in Chinese Patients
　　BU Yi-ying,YANG Song-lin,WAN Wei-dong,ZHENG Jiang-hong, DENG Chen-liang,DING Zhi,MAO Guang-yu
　　（Department of Plastic Surgery, Shanghai Sixth People"s Hospital, School of Medicine,Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200233，China）
　　
　　Abstract： ObjectiveThe relationship between nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate（NSCL/P）and genetic polymorphism of TBX22 in Chinese population were explored． Methods Eighty NSCL/P cases-parent trio were selected as the case group. Meanwhile, 80 unimpaired children were selected as the control group. Case-control study design was employed. TBX22 gene, the fragments including G359A、A361G（in exon 3 of TBX22 gene）were amplified by PCR, then the PCR products were directly sequenced to detect the polymorphism and the genetype. The comparison of genetype and allele frequency was made between the patients with NSCL/P and control subjects. Haplotype Relative Risk （HRR） and Transmission Disequilibrium Test （TDT） of involved family were also analyzed. ResultsThere was no genetic polymorphism in A361G, but genetic polymorphism was detected in G359A. The genotype frequency of case-control study showed that there was significant association between TBX22 variant and the risk of NSCLP．The difference of HRR and TDT between the two groups had no significant results.ConclusionThere may have some correlativity between the genetic polymorphism of TBX22 G359A and the pathogenesis of NSCL/P in population of southeast China, and TBX22 G359A might be the susceptibility gene and the susceptibility locus.
　　Key words：NSCL/P; Genetic polymorphism; TBX22 gene
　　
　　非综合征性唇腭裂（nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate, NSCL/P）是一种常见的先天性疾病，指不伴有其他器官畸形、不在综合征之内的唇裂、唇裂合并腭裂或单纯腭裂的总称[1-3]。NSCL/P发病原因仍不明确，是一种由遗传和环境等因素相互作用所致的多基因遗传疾病[4]。目前文献已报道出多个候选基因，TBX22基因就是其中之一[5]。TBX22属于T-box转录因子家族，为主要调控胚胎生长发育过程中的转录因子。TBX22在早期发育和中胚层特异性分化过程中起作用。另有研究表明TBX22突变可能导致唇腭裂的发生。但国内外相关报道较少，且因为地域环境和种族差异的影响，该基因在不同文献中结果不尽相同。本项研究通过测序技术试图探讨TBX22基因的突变情况与华东地区人群非综合征性唇腭裂发病之间可能存在的关系。
　　
　　1材料和方法
　　1.1 对象：80例NSCL/P核心家庭，80个NSCL/P 例患儿,均为东南大学附属中大医院整形烧伤科住院手术的唇腭裂畸形患儿，其中唇裂15例，腭裂30例，唇裂合并腭裂35例，经整形外科医师确诊，排除了其他系统畸形或综合征之内的唇腭裂病例，如Van Der Woude综合征、Meckel综合征、歌舞伎面谱综合征、腭心面综合征。对照组80例儿童均为南京市儿童医院“上感”就诊患儿。两组儿童均来自中国安徽、江苏地区，均为汉族，年龄、性别分布也无差异。研究对象均对本项研究签署了知情同意书。
　　1.2 试剂及仪器：Puregene DNA纯化试剂盒（美国GENTRA公司）；高保真PfuPCR试剂盒（南京天为有限公司）；扩增引物由上海英骏生物公司合成；MG5331 PCR扩增仪（德国Eppendorf公司）。
　　1.3 DNA提取：样品采集：抽取患儿及父母、对照儿童外周静脉血4ml，EDTA抗凝。按PUREGENE DNA纯化试剂盒的说明书抽提外周血白细胞基因组DNA。
　　1.4 PCR扩增：扩增引物：上游引物为：5"-TGTGTGCACA TGGTGGAGGT-3"；下游引物为5"-AGTGAGACTCCATCTCAGGA-3"。反应体系：总反应体系25μl，其中上下游引物各1μl（10pmol/μl），模板DNA 0.5μl（100ng/μl），2×Pfu PCR Master Mix 12.5μl，ddH2O 10μl。PCR反应条件：94℃变性3min，PCR循环条件为94℃30s，58℃30s，72℃30s，共30个循环，最后72℃延伸4min。1.6%琼脂糖凝胶电泳，EB染色检测PCR扩增结果。
　　1.5 纯化测序：纯化测序由华大基因科技有限公司完成。对发现阳性结果的核心家庭进行重复测序，以检测测序结果的可靠性，若两次结果不一致，再进行双向测序，保证测序结果的可信度。测序引物由测序公司设计合成。
　　1.6 测序结果判读：用Chromas 2.0软件对测序峰图进行分析，判断杂合子和纯合子，从而得到核心家庭的基因序列，用Dnastar软件对核心家庭的基因序列与Pubmed提供的正常序列进行对比，发现突变位点。
　　1.7 统计学处理：统计由SPSS14.0软件完成，进行如下统计：①患儿组与父母组基因型分别做Hardy-Weinberg平衡检验；②比较实验组患儿与对照组儿童的基因型构成及等位基因频数做卡方检验；③对核心家庭的父母及患儿各位点基因型及等位基因频数进行比较和单体型相对风险分析（Haplotype relative risk, HRR）；④选取亲代至少有1位是杂合子的核心家庭作传递不平衡检验（transmission disequilibrium test, TDT）。
　　
　　2结果
　　2.1 PCR产物结果：TBX22基因exon3扩增的片段长度为251bp，PCR产物凝胶电泳图如图1。
　　2.2 测序结果：TBX22基因exon3扩增片段包含G359A、A361G突变位点。本研究测序结果与NCBI GeneBank数据库公布的TBX22序列比对后，发现G359A位存在多态性：图2对应63位碱基为G，图3对应65位碱基为A（这些位点均对应TBX22基因G359A位点）。A361G位点如图2所示对应65号位点为A，其余测序结果均未发现突变。
　　2.3 TBX22基因G359A多态性的统计学分析
　　2.3.1 患儿及其父母和对照儿童各位点的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡检验（P>0.05）,见表1。
　　2.3.2 患儿与对照儿童基因型及等位基因频数比较，80例患儿中，GG基因71例，GA基因8例，AA基因1例；对照组80例中，GG基因79例，仅发现1例GA基因。组间进行卡方见，P0.05，见表3。
　　2.3.4 传递不平衡检验计算中发现有11个核心家庭至少父母一方为杂合子，以患儿等位基因为病例，以父母未传递给患儿的一对等位基因为对照进行1:1配对的病例对照研究。结果TDT（χ2）=0.529，P>0.05，无统计学意义，见表4。
　　3讨论
　　3.1 唇腭裂是人类比较常见的出生缺陷之一，这种先天性畸形的发病率因国家、地区、种族不同而有所差异，平均约为1/700，其中亚洲发病率较高约1/500，欧洲居中约1/1000，非洲最低约1/2500[6]。唇腭裂的病人常常因为喂养困难、咬合、构音功能异常及外貌导致的心理问题等需要外科手术和后续的序列治疗，给家庭和社会带来沉重的负担[7]。根据是否存在其他先天畸形，可分为综合征型和非综合征型唇腭裂。以非综合征型唇腭裂为常见，它又可分为唇裂伴或不伴腭裂（nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate, NSCL/P）以及单纯性腭裂（cleft palate only, CPO）。研究认为，70%的CL/P和50%的CPO是非综合征型的。
　　3.2 非综合征型唇腭裂的病因则涉及到多种因素，其中遗传和环境因素都起到了重要作用。对于遗传因素的研究，国内外学者采取全基因组扫描（Genome Scanning）的方法用于唇腭裂的基因定位，从中选择可能的候选基因进行基因变异检测。但这种方法工程浩大，耗时耗力，需要投入大量的时间和资金，且效果甚微。随后一些学者应用综合征型唇腭裂的易感基因作为候选基因来推断NSCL/P的基因[8]。首先综合征性唇腭裂大多为单基因疾病，符合孟德尔遗传定律，研究较方便，干扰因素少，且其综合征性唇腭裂部分表型同NSCL/P一致。目前发现的相关易感基因包括：IRF6（Van der Woude综合征,VWS）, PVRL1（外胚层发育不良综合征,CLPED1），P63（先天性缺指/趾畸形-外胚层发育不良-唇腭裂综合征,EEC），FGFR1（Kallmann综合征），MSX1（牙缺失合并唇腭裂，cleft lip and/or palate with hypodontia）等。近来关于综合征型唇腭裂的基因研究取得了很大进展，部分易感基因已在NSCL/P研究中明确作用，如：IRF6、PVRL1、MSX1。
　　3.3 Forbes对一个冰岛家庭和一个英国哥伦比亚家庭的研究后, 将引起X 连锁腭裂（X- linked cleft palate, CPX）的基因定位于Xq21.3[9]。Braybrook通过对冰岛CPX 大家系进行候选基因分析后发现TBX22 有突变[10]。CPX患者临床表现各异，除了有腭裂以外，还可能表现为悬雍垂裂或缺失、舌系带过短等。至今已发现CPX患病人群有十个突变位点，其中包括剪接位点突变，错义突变，无义突变,编码框移位。这些在家族中的基因突变，确认了TBX22为CPX的致病基因[11]。在一个NSCL/P的同胞配对分析中, X 染色体TBX22基因所在区域也得到了较高的LOD值，说明这一区域也有可能与NSCLP 有相关[12]。随后，Suphapeetiporn K将CPX的TBX22基因突变应用于泰国人群的NSCL/P的研究中，发现TBX22有突变与泰国人群NSCL/P的发生有关[13]。
　　3.4 TBX22属于T-box基因家族[14]。1927年首次报道了x射线诱导突变产生了一种短平尾巴小鼠，导致这种鼠短尾表型的基因被称为鼠短尾（Brachyury）基因或简称T（T代表Tail）基因。随后研究Brachyury基因编码的蛋白发现它具有特异的DNA结合域，可结合200bp的特异性DNA，而与其结合的所有DNA序列都存在一致性序列AGGTGTGA[15]，因此编码该蛋白的基因称为T-box基因。最近的研究发现T-box广泛存在脊椎动物中，目前已显示人、鼠、鸡、蝾螈、斑马鱼等物种的遗传物质能表达T-box，这些能表达T-box的基因被称为TBX基因。不同物种的TBX基因表达的DNA结合域具有高度的同源性，在同一物种之内和不同物种之间这种同源性都有很好的体现，提示TBX基因有高度保守性，在胚胎发育过程中起相似作用[16]。TBX22起着转录因子的作用，特别在早期发育和中胚层特异性分化过程中起作用。在人类和小鼠的时间和空间的原位杂交研究表明其在腭部和舌体中表达，可能与腭裂的发生有关[17]。
　　3.5 本文选定TBX22的exon 3编码区为目的片段。exon 3属于DNA结合域，国外对DNA结合域的基因序列研究较多，DNA结合域在胚胎发育期间，与转录因子的结合及作用有重要关系。且在泰国人群exon3发现基因突变有统计意义，泰国人群与中国人群的人群分布较为接近，较有意义。国外报道的突变位点G359A、A361G均位于该外显子，且位置临近。对NSCL/P患儿及其父母、正常对照组进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验，结果发现患儿组基因型分布没有偏离Hardy-Weinberg定律（P>0.05），这一结果说明研究对象虽为随机抽取，但不存在人群分层现象，具有一定的代表性。本研究采取传统病例-对照设计和核心家庭的病例-父母对照研究，进行了TDT和HRR检验。结果示G359A位点病例-对照检验中P